普魯蘭酶活性測定試劑盒,微板法

普魯蘭酶活性測定試劑盒,微板法

普魯蘭酶活性測定試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 普魯蘭酶活性測定試劑盒說明書 （貨號：WS8750W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 普魯蘭酶是一種水解酶，廣泛存在于微生物及動物、植物體內，能專一地分解淀粉和 糖原及其衍生物分枝點的α-1.6-葡萄糖昔鍵。它的這種特性最早被用于淀粉結構的理論 研究，到七十年代,普魯蘭酶的應用已擴展到淀粉糖漿、啤酒和酒精生產等多個淀粉深加 工領域，并逐步從實驗室階段走向工業化規模。 普魯蘭酶催化普魯蘭分解產生還原糖，進一步與 3,5－二硝基水楊酸反應，生成棕紅色 氨基化合物，經光譜掃描在 540nm 有特征光吸收，在一定范圍內 540nm 光吸收值與還 原糖生成量成正比。通過光吸收增加速率來計算普魯蘭酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑×1 瓶 4℃保存 用前甩幾下使粉劑落入底部，再 加入 22mL 試劑一充分溶解備 用；用不完的試劑 4℃保存; 試劑三 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、低溫離心機、水浴鍋、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、普魯蘭酶活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱樣本 0.1g（水分充足的樣本可取 0.5g）于研缽中，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿后 轉入離心管中。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 ② 液體樣本：直接測定。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： 1 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 20 20 （95℃煮沸 10min 的酶液） 試劑二 100 100 混勻，50℃孵育 30min 試劑三 100 100 混勻，95℃水浴 10min（用封口膜纏緊，以防止水分散失），流 水冷卻至室溫。 蒸餾水 500 500 混勻，取出 200μL 至 96 孔板中，于 540nm 處讀取吸光值 A， ΔA＝A 測定-A 對照（每個樣本做一個自身對照）。本試劑盒僅供科研使用 2 【注】：1.若 A 測定管的吸光值大于 2，可以用蒸餾水對整個顯色混合液用蒸餾水進行稀釋（如取 顯色混合液 100μL 至 96 孔板中，再加 100μL 蒸餾水，即稀釋 2 倍），則稀釋倍數 D 需 代入公式計算。或減少上清液體積 V1（如減至 10μL，則加 10μL 蒸餾水補齊），則 V1 需代入公式重新計算。 2.若ΔA 值在零附近徘徊，可增加樣本加樣體積 V1（如增至 40μL，則最后蒸餾水體積相 應減少，保持反應總體積不變），或延長 50℃孵育時間 T（如增至 60min），則相應的 V1 和反應時間 T 需代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程為 y = 8.154x - 0.0438；x 為標準品質量（mg），y 為ΔA。 2、按蛋白濃度計算： 單位定義：37℃每毫克蛋白每分鐘產生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位。 普魯蘭酶活性（μg/min /mg prot）=[(ΔA+0.0438)÷8.154×103]÷(V1×Cpr )÷T =204.4×(ΔA+0.0438)÷Cpr 3、按鮮重計算： 單位定義：37℃每克組織每分鐘產生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位。 普魯蘭酶活性（μg/min /g 鮮重）=[(ΔA+0.0438)÷8.154×103]÷(W×V1÷V2)÷T =204.4×(ΔA+0.0438)÷W 4、按液體樣本計算： 單位定義：37℃每毫升液體樣本每分鐘產生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位。 普魯蘭酶活性（μg/min /mL 液體）=[(ΔA+0.0438)÷8.154×103]÷W×V1÷T =204.4×(ΔA+0.0438) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入反應體系中樣本體積，0.02mL； T---反應時間，30min； W---樣本鮮重，g； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的蛋白含量(考馬斯亮藍法)試劑盒，不 建議使用蛋白含量(BCA 法) 試劑盒； 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（5mg/mL）：向標準品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 1, 2, 3, 4, 5. mg/mL。也可根據實際樣本來 調整標準品濃度。 3 按照：20μL 標準品+100μL 蒸餾水+100μL 試劑三，95℃水浴 10min，冷卻后，再加 500μL 蒸餾水，混勻，取 200μL 至 96 孔板中，540nm 下測定，根據結果即可制作 標準曲線。