濾紙酶(FPA)試劑盒,微板法

濾紙酶(FPA)試劑盒,微板法

濾紙酶(FPA)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 濾紙酶（Filter paper Activity，FPA）試劑盒說明書 （貨號：WS5550W 微板法 48 樣） 一、產品簡介： 纖維素酶是由微生物產生的多組分的酶系，能水解纖維素β-1,4 葡萄糖苷鍵生成葡萄糖， 研究濾紙酶活力對纖維素酶的研究具有非常重要的意義。 濾紙酶水解濾紙產生的還原糖能與 3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色氨基化合物，在 540nm 處有光吸收，在一定范圍內反應液顏色深淺與還原糖的量成正比，可測定計算得濾紙 酶的活力。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 濾紙條×100 根 4℃保存 試劑一 液體 80mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體 50mL×1 瓶 4℃保存 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、天平、研缽、低溫離心機、恒溫水浴鍋、可調式移液器。 四、濾紙酶（FPA）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 蒸餾水，進行冰浴勻漿。 4℃×12000rpm 離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 ② 細菌或培養細胞 先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細胞加入 1mL 蒸餾 水，超聲波破碎細菌或細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；4℃×12000rpm 離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照數量（104）：提取液體積(mL)為 500-1000：1 的比例進行提取 ③ 液體樣本：若是澄清液體，直接檢測，若液體樣本渾濁，需 4℃×12000rpm，離心 10min， 取上清液檢測。 2、上機檢測： 1 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 540nm。 2 所有試劑至常溫（25℃）狀態。 3 每個樣本需一個自身對照即煮沸樣本：樣本于 95-100℃水浴鍋中煮沸 10min 即可。 4 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 100 100（煮沸樣本） 濾紙條 1 根 1 根 試劑一 800 800 50℃孵育 60min 試劑二 400 400 混勻，沸水浴（95-100℃）5min，冷卻至室溫本試劑盒僅供科研使用 2 蒸餾水 400 400 混勻，取出 200μL 待檢液至 96 孔板中，于 540nm 處讀 取吸光值 A，ΔA=A 測定-A 對照（每個樣本做一個樣 本自身對照）。 【注】1.若 A 測定值超過 1.5，可適當對樣本進行稀釋再檢測，或者取 200μL 至 96 孔板前 行稀釋（如吸取 100μL 待檢液+100μL 蒸餾水，相當于稀釋 2 倍）,則相應的稀釋倍數 D 需代入計算公式計算。 2. 若ΔA 差值接近零，可增加樣本體積 V1（如增至 200μL，則蒸餾水相應減少，保持總體 積不變）或延長反應時間 T（如增至 2h）或增加取樣質量 W，則改變后的 V1 和 T 和 W 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程為：y = 3.6433x + 0.0016，x 是標準品質量（mg），y 是ΔA。 2、按照蛋白濃度計算 定義：50℃下，每毫克蛋白每小時分解濾紙產生 1mg 葡萄糖所需酶量為一個酶活單位。 FPA(mg/h/mg prot)=[(ΔA-0.0016)÷3.6433]÷(V1×Cpr)÷T×D=2.74×(ΔA-0.0016)÷Cpr×D 3、按照樣本質量計算 定義：50℃下，每克組織每小時分解濾紙產生 1mg 葡萄糖所需的酶量為一個酶活單位。 FPA(mg/h/g)=[(ΔA-0.0016)÷3.6433]÷(W×V1÷V)÷T×D=2.74×(ΔA-0.0016)÷W×D 4、按液體體積計算 定義：50℃下，每毫升液體每小時分解濾紙產生 1mg 葡萄糖所需酶量為一個酶活單位。 FPA(mg/h/mL)=[(ΔA-0.0016)÷3.6433]÷V1÷T×D=2.74×(ΔA-0.0016)×D 5、按細胞數量計算 定義：50℃下，每 104個細胞每小時分解濾紙產生 1mg 葡萄糖所需酶量為一酶活力單位。 FPA(mg/h/104cell)=[(ΔA-0.0016)÷3.6433]÷(V1×細胞數量÷V)÷T×D =2.74×(ΔA-0.0016)÷細胞數量×D V---提取液體積，1mL； V1---反應體系中加入樣本體積，0.1mL； W---樣本質量，g； T---反應時間，60min=1 小時； D---稀釋倍數，未稀釋即為 1; Cpr---樣本蛋白濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（5mg/mL）：向標準品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 0.6, 1.2, 1.8, 2.4, 3. mg/mL。也可根據實際 樣本來調整標準品濃度。 3 100μL 標準品+800μL 試劑一+400μL 試劑二，混勻，沸水浴（95-100℃）5min，冷 卻至室溫，再加 400μL 蒸餾水，混勻后取出 200μL 待檢液至 96 孔板中，于 540nm 處讀取吸光值 A。根據結果即可制作標準曲線。