α-半乳糖苷酶(α-GAL)試劑盒,微板法

α-半乳糖苷酶(α-GAL)試劑盒,微板法

α-半乳糖苷酶(α-GAL)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase, α-GAL）試劑盒說明書 （貨號：WS3250W 微板法 48 樣） 一、產品簡介： α-半乳糖苷酶(α-GAL，EC 3.2.1.22)可特異性地水解多糖、糖脂、糖蛋白中糖鏈末端 的α-半乳糖苷鍵。在人、動物、植物、微生物體內均存在。在食品飼料和醫藥等領域中 有著廣泛的應用前景。 本試劑盒提供一種簡單，靈敏，快速的測定方法，α-GAL 分解對-硝基苯-α-D-吡喃半 乳糖苷生成黃色的對-硝基*酚（PNP），后者在 405nm 有吸收峰，通過測定吸光值 升高速率來計算α-GAL 活性。 二、測試盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 4℃保存 臨用前加 1.5ml 水。 試劑二 液體 5mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液 20mL×1 瓶 4℃保存 標準品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、α-半乳糖苷酶（α-GAL）活性檢測： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，冰浴 勻漿，然后 12000rpm，4℃，離心 10min，取上清作為粗體液，置于冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 ② 細菌或細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細 胞，加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s， 間隔 10s，重復 30 次）；15000 rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積（mL)為 500~1000:1 比例進行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，溫度設定 37℃，波長設定為 405nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 10 10 試劑一 25 蒸餾水 25 試劑二 35 35 迅速混勻，37℃保溫 30min 試劑三 180 180本試劑盒僅供科研使用 2 混勻， 取 200μL 轉移到 96 孔板中，405nm 處測定吸光 值 A，ΔA=A 測定-A 對照。每個測定管需設一個對照管。 【注】：若ΔA 過小，可以延長保溫時間（如：40min 或更長），或增加樣本上樣量 V1 （如增至 30μL，則試劑三相應減少），則改變后的 T 或 V1 需重新代入計算公式計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y = 0.0438x - 0.0008：x 是標準品 PNP 的質量（nmol），y 是ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產生 1nmol 對-硝基*酚(PNP)定義為一個酶活單位。 α-GAL 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0008)÷0.0438]÷(V1×Cpr)÷T=76.1×(ΔA+0.0008)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織每分鐘產生 1nmol 對-硝基*酚(PNP)定義為一個酶活單位。 α-GAL 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0008)÷0.0438]÷(W×V1÷V)÷T=76.1×(ΔA+0.0008)÷W 4、按細菌或細胞密度計算： 單位定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產生 1nmol 對-硝基*酚定義為一個酶活性單位。 α-GAL 活性(nmol/min/104cell)=[(ΔA+0.0008)÷0.0438]÷(500×V1÷V)÷T=0.152×(ΔA+0.0008) 5、按液體體積： 單位定義：每毫升液體每分鐘產生 1nmol 對-硝基*酚(PNP)定義為一個酶活單位。 α-GAL 活性(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0008) ÷0.0438]÷V1÷T=76.1×(ΔA+0.0008) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入反應體系中樣本體積，0.01mL； W---樣本質量，g； T---反應時間，30min； PNP 對分子質量---139.11； 500---細胞或細菌數量，萬； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（1mg/mL）：向標準品 EP 管里面加入 1ml 蒸餾水。 2 把母液用蒸餾水稀釋成以下濃度梯度的標準品：0, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3mg/mL。也 可根據實際樣本來調整標準品濃度。 3 在 EP 管加入：10μL 標準品+25μL 蒸餾水+35μL 試劑二+180μL 試劑三，混勻，取 200μL 至 96 孔板中，于 405nm 下讀取吸光值。 4 根據結果制作標準曲線。