ADPG焦磷酸化酶,微板法

ADPG焦磷酸化酶,微板法

ADPG焦磷酸化酶,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase， AGP）活性測定試劑盒說明書 （貨號：WS6350W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： ADPG 焦磷酸化酶(AGP，EC 2.7.7.27)是植物淀粉合成過程中起關鍵性調節作用的酶， 催化 l-磷酸葡萄糖(G-1-P)與三磷酸腺苷(ATP)反應形成淀粉合成的直接前體腺苷二磷酸葡 萄糖(ADPG)，在植物中，主要存在于貯藏器官和葉片中。 AGP 催化的逆向反應生成 G1P，在反應體系中添加的磷酸己糖變位酶和 6-磷酸葡萄糖 脫氫酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH，340nm 下測定 NADPH 增加速率，即可 計算 AGP 活性。 二、測試盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體120mL×1瓶 4℃保存 試劑一 粉體mg×1支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，再 加1.1mL蒸餾水溶解，仍-20℃保存。 試劑二 粉體mg×1支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，再 加1.1mL蒸餾水溶解。仍4℃保存。 試劑三 液體13mL×1瓶 4℃保存 試劑四 粉體mg×1支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，再 加 2.1mL 蒸餾水溶解，仍-20℃保存。 【注】：粉劑量在 mg 級別，使用前用手甩幾次或者進行離心，打開直接加入要求的試劑即可。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.2g），加 1mL 提取液，進行冰浴勻漿， 12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：也可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取。 【注意】 若樣本顏色較深（如較深顏色的植物葉片），可引起起始值 A1 值較大如超過 1.5，可在樣本 制備過程中增加除色素步驟：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 80%乙醇冰浴勻漿， 12000rpm，4℃離心 10min，棄掉色素較深的上清液；以上除色素步驟重復 2 次。最后向離心得到的 沉淀中加入 1mL 提取液，混勻或再次冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。 ② 液體樣品：澄清的液體樣本直接檢測；若渾濁則離心后取上清液檢測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，設定溫度為 30℃。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃），在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 40 試劑一 10本試劑盒僅供科研使用 2 試劑二 10 試劑三 120 輕輕混勻，30℃孵育 10min。 試劑四 20 輕輕混勻，反應開始，30℃條件下，30S 在 340nm 處讀取 吸光值 A1，30min 后讀取 A2，△A=A2-A1。 【注】1. 若ΔA 在零附近徘徊，可延長反應時間 T 至 60min 后或更長讀取 A2；或加大樣本上樣量 V1（如增至 80μL，則試劑三相應減少，保持總體積不變）；或增加樣本取樣質量 W； 則改變后的 T 和 V1 以及 W 需代入計算公式重新計算； 2. 若上升趨勢不穩定，可以每隔 10S 讀取一次吸光值，選取一段線性上升的時間段來參與 計算，相對應的 A1 和 A2 值也代入計算公式重新計算。 3. 若△A 的值大于 0.4，需縮減反應時間 T（如減至 10min 或更短），或減少樣本上樣量 V1 （如減至 20μL，則試劑三相應增加，保持總體積不變）；則改變后反應時間 T 和 V1 需 代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、按樣本蛋白蛋白濃度計算 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產生 1nmol NADPH 定義為一個酶活性單位。 AGP(nmol/min /mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=53.6×ΔA÷Cpr 2、按照樣本鮮重計算 酶活定義：每克組織每分鐘催化產生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。 AGP(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=53.6×ΔA÷W 3、按照液體體積計算： 酶活定義：每毫升液體每分鐘催化產生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。 AGP(nmol/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T =53.6×ΔA ε---NADPH 摩爾消光系數，6.22×103 L/mol/cm； V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.04mL； V2---反應體系總體積，2×10-4 L； d---比色皿光徑，0.5cm； T---反應時間，30min； W---樣本質量，g ； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。