UDPG焦磷酸化酶試劑盒,微板法

UDPG焦磷酸化酶試劑盒,微板法

UDPG焦磷酸化酶試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphosphprylase，UGP）試 劑盒說明書 （貨號：WS5350W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： UDPG 焦磷酸化酶（UGP，EC 2.7.7.9）是碳水化合物代謝的重要指標之一，廣泛 分布于自然界中，在微生物及動植物的許多組織中都有存在。催化葡萄糖活化，將 1- 磷酸葡萄糖與 UTP 分子合成為 UDP-葡萄糖（UDPG）。為各類碳水化合物包括蔗糖、 葡聚糖、纖維素、半纖維素、果膠質、糖蛋白等的合成提供葡萄糖基。 UGP 可逆催化反應生成 1 磷酸葡萄糖，在磷酸葡萄糖變位酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶 作用下將 NADP 轉化為 NADPH，340nm 的吸光值增加速率反映了 UGP 活性。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體15mL×1瓶 4℃保存 試劑二 粉體×1支 -20℃保存 臨用前加1.1mL試劑一溶解， 仍-20℃保存。 試劑三 粉體mg×1瓶 4℃保存 臨用前加 5.4mL 去離子水溶解。 試劑四 粉體mg×1瓶 4℃保存 臨用前加 5.4mL 去離子水溶解。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、可調式移液器、天平、低溫離心機、研缽、蒸餾水。 四、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.2g），加 1mL 提取液，進行冰浴勻漿， 12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：也可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取。 ② 細胞樣本： 取 500 萬細胞加入 1mL 提取液；超聲波破碎細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細胞數量（104 個）：提取液體積（mL）為 1000~5000：1 的比例進行 提取 ③ 液體樣品：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min，調節波長至 340nm，設定溫度為 30℃。 ② 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 10 試劑一 80 試劑二 10本試劑盒僅供科研使用 2 【注】1. 若ΔA 差值在零附近徘徊，可以延長反應時間 20min 后讀取 A2，則相應的 反應時間 T 則代入計算公式重新計算； 或者加大樣本上樣量（如：由 10μL 增加到 20μL，則試劑一相應減少，保持 總體積 200μL 不變），改變后的加樣體積即 V1 代入計算公式重新計算； 或者由 0.1g 樣本取樣量增加到 0.2g，加 1mL 的提取液研磨提取。 2. 若上升趨勢不穩定，可以每隔 10S 讀取一次吸光值，選取一段線性 上升的時間段來參與計算，相對應的 A1 和 A2 值也代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、按照樣本蛋白濃度計算 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADP 定義為一個酶活力單位。 UGP（nmol/min/mg prot）＝[△A÷（ε×d）×V2×109]÷（V1×Cpr）÷T =1607.8×△A÷Cpr （2）按照樣本質量計算 酶活定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADP 定義為一個酶活力單位。 UGP（nmol/min /g 鮮重）＝[△A÷（ε×d）×V2×109]÷（W ×V1÷V）÷T =1607.8×△A÷W （3）按照細胞數量計算 酶活定義：每 104 個細胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADP 定義為一個酶活力單位。 UGP（nmol/min /104 cell）= [△A÷（ε×d）×V2×109]÷(500×V1÷V) ÷T =3.2×△A （4）按照液體體積計算 酶活定義：每毫升液體每分鐘消耗 1 nmol 的 NADP 定義為一個酶活力單位。 UGP（nmol/min /mL）=[△A÷（ε×d）×V2×109]÷V1÷T=1607.8×△A ε---NADPH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm； V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.01mL； V2---反應體系總體積，2×10-4 L； d---96 孔板光徑，0.5cm； T---反應時間，4min； 500---細胞總數，500 萬； W---樣本質量，g ； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 試劑三 50 輕輕混勻，30℃孵育 10min。 試劑四 50 輕輕混勻，反應開始，1min 時在 340nm 處讀取吸光值 A1， 5min 時讀取 A2，△A=A2-A1。