腺苷脫氨酶（ADA)活性測定試劑盒,微板法

腺苷脫氨酶（ADA)活性測定試劑盒,微板法

腺苷脫氨酶（ADA)活性測定試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 腺苷脫氨酶（Adenosine deaminase, ADA)活性測定試劑盒說明書 (貨號：WS8340W 微板法 96 樣) 一、產品簡介： 腺苷脫氨酶（ADA，EC 3.5.4.4）是一種琉基酶，是嘌呤核苷酸代謝的關鍵酶，與機體 細胞的免疫活性有重要關系。 腺苷脫氨酶（ADA）催化腺嘌呤核苷水解，產生次黃*呤核苷和氨，利用氨在強堿的 環境下與次氯酸鹽和*酚作用，生成水溶性染料靛酚藍，溶液顏色穩定。其在 630nm 處 有特征吸收峰，通過檢測氨增加的速率，即可計算該酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×2 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，每瓶 再加 11mL 蒸餾水溶解備用。 試劑三 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 12mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 試劑六 A：液體 3.5mL×4 瓶 B：液體μL×1 支 4℃保存 臨用前取 30μL 的 B 液進一瓶 A 液中， 混勻后作為試劑六使用。混勻后的試 劑六一周內用完。 標準管 液體 mL×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該標曲。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、可調式移液槍、研缽、冰和蒸餾水。 四、腺苷脫氨酶（ADA）活性測定： 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織（水分足的樣本可取 0.2-0.5g），加入 1mL 提取液；進行 冰浴勻漿。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：也可以按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取。 ② 液體樣本：直接檢測；若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 630nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃），在 EP 管依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 40 40 試劑一 100 100 試劑二 100 試劑三 100 混勻，放入 37℃水浴鍋或恒溫培養箱中孵育 30min 試劑三 100 試劑二 100 混勻，室溫 12000rpm 離心 5min，上清液待測。 ③ 顯色反應：在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管本試劑盒僅供科研使用 2 上清液（上步反應） 30 30 蒸餾水 30 30 試劑四 60 60 試劑五 30 30 試劑六 60 60 充分混勻，37℃放置 20min 后，于 630nm 處讀取吸光值 A， ΔA=A 測定管-A 對照管（每個樣本做一個自身對照）。 【注】1. 試劑四和五和六需分開加，不能事先混勻。 2. 若ΔA 的值較小，可增加 37℃孵育時間（如增至 1 小時或更長），或在顯色階段增加上清液量 V1(如增至 60μL，則蒸餾水體積相應減少)；則改變后的 T 和 V1 需代入計算公式重新計算。 3. 若 A 測定大于 1.5，可減少 37℃孵育時間（如減至 10min 或更短），或在顯色階段減少上清液 量 V1(如減至 15μL，則蒸餾水體積相應增加)；則改變后的 T 和 V1 需代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程為 y = 58.121x - 0.0118；x 為標準品摩爾質量（μmoL），y 為吸光值ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克蛋白質每小時催化腺苷生成 1μmoL 氨定義為一個酶活力單位。 ADA(μmoL/h/mg prot)=(ΔA+0.0118)÷58.121×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T =9.75×(ΔA+0.0118)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織每小時催化腺苷生成 1μmoL 氨定義為一個酶活力單位。 ADA (μmoL/h/g 鮮重)=(ΔA+0.0118)÷58.121×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T =9.75×(ΔA+0.0118)÷W 4、按照液體體積計算： 單位定義：每毫升液體每小時催化腺苷生成 1μmoL 氨定義為一個酶活力單位。 ADA (μmoL/h/mL)=(ΔA+0.0118)÷58.121×(V2÷V3)÷V1÷T=9.75×(ΔA+0.0118)÷W V---提取液體積，1mL； V1----加入②歩反應體系中樣本體積，0.04mL； V2---②歩反應體系總體積：0.34mL； V3---③歩顯色步驟中上清液體積，0.03mL； T---反應時間，0.5h； W---樣本質量； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 標準品母液（10μg/mL 的氨（分子量是 18）），把母液用蒸餾水稀釋成以下濃度梯度 的標準品：0, 2, 4, 6, 8, 10 μg/mL。也可根據實際樣本來調整標準品濃度。 2 按照顯色反應階段的測定管加樣體系操作，根據結果即可制作標準曲線。