磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性試劑盒微板法

磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性試劑盒微板法

磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 磷脂酸磷酸酯酶（Phosphatidate phosphatase）活性測定試劑盒 （貨號：WS2290W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 磷脂酸磷酸酯酶也稱為磷酸化酶磷酸酯酶（EC 3.1.3.17，PPase）是磷酸酯酶中的一種， 在脂類合成的信號傳遞中發揮著重要作用，其活性對含油量的提高具有重要意義，可作為 育種選擇高含油量品種的生化指標。 本試劑盒利用磷脂酸磷酸酯酶（PPase）催化β-甘油磷酸分解產生無機磷分子，通過定 磷試劑測定無機磷增加速率，即可得出磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 【注】:全程需無磷環境；試劑配置用新槍頭和玻璃移液器等，也可用一次性塑料器皿，避免磷污染。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、低溫離心機、水浴鍋或恒溫培養箱、可調式移液器、研缽、冰。 四、磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。4℃×12000rpm 離 心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取。 ② 液體樣本：直接檢測；若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30 min 以上，調節波長到 700nm，所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ② 依次在 EP 管孔板中加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 試劑一 200 200 試劑二 50 50 樣本 50 35℃ 孵育 30min 試劑三 100 100 樣本 50 混勻，12000rpm，4℃離心 5min，上清液待測 ③ 顯色反應，在 96 板中加入： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 40mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉末全部落入底部， 加入 11mL 蒸餾水混勻溶解備用。 試劑三 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 A:粉體 mg×1 瓶 B:液體 4mL×1 瓶 4℃保存 臨用前在試劑 A 中加 3.6mL 的 B 液， 再加 46.4mL 的蒸餾水，混勻溶解備用。 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑。 上清液 50 50本試劑盒僅供科研使用 2 【注】若△A 在零附近，可增加樣本加樣體積 V1（如增至 100μL，則試劑一相應減少）， 或延長反應時間 T（如增至 1 小時），則改變后的 V1 和 T 需代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y=0.6161x - 0.0038，x 是標準品濃度（μmol/mL）, y 是△A。 2、按蛋白濃度計算： 定義：每小時每毫克組織蛋白催化產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 PPase 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(△A+0.0038)÷0.6161×V2] ÷(V1×Cpr)÷T =26×(△A+0.0038)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 定義：每小時每克組織催化產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 PPase 酶活力(μmol/h/g 鮮重)=[(△A+0.0038)÷0.6161×V2]÷(W×V1÷V)÷T =26×(△A+0.0038)÷W 4、液體中 PPase 活力計算: 定義：每小時每毫升液體催化產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 PPase 酶活力(μmol/h/mL)=[(△A+0.0038)÷0.6161×V2]÷V1÷T=26×(△A+0.0038) V---提取液體積，1mL； V1---樣本體積，0.05mL ； V2---酶促反應總體積，0.4mL； T---反應時間，1/2 小時； W---樣本鮮重，g； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1. 制備標準品母液（50μmol/mL）：標準品用 1mL 試劑一溶解。（母液需在兩天內用）。 2. 把母液用蒸餾水稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根據實際樣本 來調整標準品濃度。 3. 依據顯色反應階段測定管的加樣體系操作，根據結果即可制作標準曲線。 試劑四 200 200 混勻，室溫靜置 3min，700nm 下讀取各管吸光值， △A=A 測定-A 對照（每個樣本做一個自身對照）。