甘油激酶（GK）活性試劑盒,微板法

甘油激酶（GK）活性試劑盒,微板法

甘油激酶（GK）活性試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 甘油激酶（GK）活性測定試劑盒說明書 （貨號：WS9190W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 甘油激酶（GK，EC 2.7.1.30）是甘油代謝中的限速酶，催化甘油磷酸化產生 3-磷酸甘 油，3-磷酸甘油在 3-磷酸甘油脫氫酶的作用下產生磷酸二羥丙酮，進入糖酵解途徑氧化分 解釋放能量。該酶的缺乏將直接導致細胞不能利用甘油。 本試劑盒采用甘油激酶催化 Mg-ATP 依賴的甘油磷酸化為 3-磷酸甘油，3-磷酸甘油在 磷酸甘油氧化酶的作用下產生過氧化氫，過氧化氫與顯色劑反應在 510nm 處有吸收 峰。通過測定 510nm 處的增加速率即可得出甘油激酶的酶活力大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底 部，臨用前加 1.1mL 蒸餾水溶解 備用。用不完的試劑 4℃保存。 試劑二 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底 部，臨用前加 1.1mL 蒸餾水溶解 備用。用不完的試劑 4℃保存。 試劑三 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 9mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 mL×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，臨用前加 2.2mL 蒸餾水溶解 備用。用不完的試劑 4℃保存。 標準品 液體 1 mL×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、可調試移液器、臺式離心機、水浴鍋、研缽、冰和蒸餾水。 四、甘油激酶（GK）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g）到研缽內，加入 1mL 提取液， 在冰上進行冰浴勻漿或者液氮研磨。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：也可以按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提?。?② 細菌/真菌樣本：先收集細菌/真菌到離心管內，離心后棄上清；取 500 萬細菌/真菌加 入 1mL 提取液；冰浴超聲波破碎細菌/真菌（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間 隔 10s，重復 30 次）；12000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：也可按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例進行提?。?③ 液體樣本：澄清的液體樣本直接檢測，若渾濁則離心后取上清液檢測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 510nm。 ② 在 96 孔板中依次加入下列試劑：本試劑盒僅供科研使用 2 【注】：加完試劑五即啟動反應，所以試劑五加完需立即混勻檢測，若ΔA 小于 0.05，可增加樣本上樣量 V1，試劑四相應減少保持原體系不變（如樣本上樣量為 20μL 時，試劑四為 80μL）；或延長反 應時間 T（如延長至 10min 或更長），則改變后的 V1 和 T 需帶入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線：y = 0.1066x-0.0277：x 為 H2O2標準品濃度(μmoL/mL)，y 為ΔA。 2、按樣本鮮重計算： 酶活定義：每克組織每分鐘催化生成 1μmoLH2O2 定義為一個酶活單位（U）。 GK(μmoL/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0277)÷0.1066×V1]÷(W×V1÷V)÷T =1.88×(ΔA+0.0277)÷W 3、按樣本蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化生成 1μmoLH2O2 定義為一個酶活單位（U）。 GK(μmoL/min/mg prot)=[(ΔA+0.0277)÷0.1066×V1]÷(V1×Cpr)÷T=1.88×(ΔA+0.0277)÷Cpr 3、按細胞數量計算： 酶活定義：每 104個細胞每分鐘催化生成 1μmoLH2O2 定義為一個酶活單位（U）。 GK(μmoL/min/104cell)=[(ΔA+0.0277)÷0.1066×V1]÷(500×V1÷V)÷T=0.004×(ΔA+0.0277) 4、按液體體積計算： 酶活定義：每毫升液體每分鐘催化生成 1μmoLH2O2 定義為一個酶活單位（U）。 GK(μmoL/min/mL)= [(ΔA+0.0277)÷0.1066×V1]÷V1÷T=1.88×(ΔA+0.0277) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.01mL； T---反應時間，5 min； W---樣本質量； 500---細胞數量； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的蛋白含量測定試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1. 用蒸餾水把母液（250mM）稀釋成以下濃度梯度的標準品：0,2,4,6,8,10mM。也可根 據實際情況來調整標準品濃度。 2. 按照測定管（樣本替換為標準品）加樣體系操作，依據結果即可制作標準曲線。 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 10 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 60 試劑四 90 混勻，37℃避光靜止 5min。 試劑五 20 混勻，37℃下，立即于 510nm 讀取吸光值 A1，避光孵育 5min 后讀取 A2。ΔA=A2-A1。