肉桂酸4-羥基化酶(C4H)試劑盒,微板法

肉桂酸4-羥基化酶(C4H)試劑盒,微板法

肉桂酸4-羥基化酶(C4H)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 肉桂酸 4-羥基化酶（C4H）試劑盒說明書 （貨號：WS1001W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 肉桂酸-4-羥基化酶（C4H，EC 1.14.13.11）是苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶。可有效調節 與之相應的黃酮類化合物等次生代謝產物的合成，其活性可作為植物抗性的一個生理指標。 本產品測試原理是以肉桂酸作為底物，在酶促反應的最適條件下，肉桂酸-4-羥基化酶催 化底物生成 4-羥基反式肉桂酸，其在 PH 值下，產物 4-羥基反式肉桂酸在 340nm 下有 吸收峰，進而計算出該酶活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 試劑規格 保存方式 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 5mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑×2 瓶 -20℃保存 用前甩幾下使粉劑落入底部， 每瓶再加 20mL 蒸餾水溶解，用 不完的試劑分裝后-20℃保存， 禁止反復凍融，一周內用完。 試劑三 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 5mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 三、所需用的儀器與用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、肉桂酸 4-羥基化酶（C4H）活性檢測： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： 稱取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液組織，進行冰浴勻 漿。12000rpm, 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 340nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑（μL） 測定管 空白管（僅做一次） 樣本 100 試劑一 50 50 試劑二 350 350 試劑三 300 400 混勻，30℃水浴反應 30min 試劑四 50 50 混勻，靜置 2min 試劑五 60 60 混勻后，取 200μL 轉移至 96 孔板，在 340nm 下讀取 吸光值 A，△A=A 測定-A 空白。本試劑盒僅供科研使用 2 【注】若△A 的值在零附近徘徊，可增加樣本加樣量（如增加至 200μL，則試劑三相應減少） 或增加反應時間 T，則改變后的加樣體積 V1 和 T 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1. 按樣本鮮重計算： 酶活定義：每克組織每分鐘產生 1nmol 的 4-羥基反式肉桂酸為一個酶活力單位。 C4H（nmol/min/g 鮮重）=[(△A÷ε÷d×V2×109) ]÷(W×V1÷V)÷T =24.8×ΔA÷W 3. 按樣本蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘產生 1nmol 的 4-羥基反式肉桂酸為一個酶活力單位。 C4H（nmol/min/mg prot）=[(△A÷ε÷d×V2×109) ]÷(V1×Cpr) ÷T =24.8×ΔA÷Cpr ε ---4-羥基反式肉桂酸在此反應條件下于 340nm 處的摩爾吸光系數，2.45×104 L/mol /cm； V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.1 mL； V2 ---反應體系總體積，910μL=9.1×10-4 L； d --96 孔板光徑，0.5 cm； T---反應時間，30 min； W---樣本質量，g； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。