花青素還原酶（ANR）試劑盒,微板法

花青素還原酶（ANR）試劑盒,微板法

花青素還原酶（ANR）試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 花青素還原酶（anthocyanidin reductase，ANR）試劑盒說明書 （貨號：WS6001W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 花青素還原酶（ANR）參與調控花青素的含量水平以及原花青素的形成，是原花青素 單體生物合成過程中關鍵酶之一，在花青素積累過程中具有重要的調節作用。 花青素還原酶（ANR）在NADPH存在下使飛燕草色素轉變為表沒食子兒茶素和NADP+， 通過檢測反應體系在 340nm 處的吸光值下降速率即可得出花青素還原酶（ANR）活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 110mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部，再 加 1.2mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 粉劑 mg×2 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部，每 支分別加 0.6mL 蒸餾水溶解備用。用不 完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復 凍融，三天內用完。 試劑三 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉劑μg×1 支 -20℃避光 保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部，再 加 1.1mL 乙醇溶解備用，用不完的試劑 分裝后-20℃避光保存，禁止反復凍融。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、無水乙醇、水浴鍋、可調式移液器、研缽、冰。 四、花青素還原酶（ANR）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織樣本，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min， 取上清置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取。 ② 液體樣本：若液體澄清可直接檢測；若渾濁則 12000rpm，4℃離心 10min，取上 清置冰上待測。 2、上機檢測： 1 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 340nm。 2 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 3 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 20 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 150 340nm，室溫（25℃）孵育 5min本試劑盒僅供科研使用 2 試劑四 10 充分混勻，立即于 340nm 處讀取吸光值 A1，后于 40℃溫育 20min 后，再讀取吸光值 A2，△A=A1-A2。 【注】1. 若ΔA 的值在零附近徘徊，可增加樣本加樣量 V1（如增至 40μL，則試劑三減少至 130μL）， 則改變后的 V1 需代入計算公式重新計算。 2. 若起始值 A1 太大如超過 2（如顏色較深的組織樣本，一般色素較高，則起始值相對會偏高）， 可以適當減少樣本加樣量 V1(如減至 10μL)，則改變后的 V1 需代入計算公式重新計算。 3. 若ΔA 的值大于 0.2，則需減少反應時間（如 40℃溫育 20min 減少至 10min），則改變后的反 應時間 T 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、按樣本蛋白濃度計算 酶活定義：40℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘氧化 1nmolNADPH 定義為一個酶活單位。 ANR 活性（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(V1×Cpr) ÷T =160.8×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計算 酶活定義：40℃條件下，每克組織每分鐘氧化 1nmolNADPH 定義為一個酶活單位。 ANR 活性（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(W×V1÷V) ÷T =160.8×ΔA÷W 3、按液體體積計算 酶活定義：40℃條件下，每毫升液體每分鐘氧化 1nmolNADPH 定義為一個酶活單位。 ANR 活性（nmol/min/mL）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷V1÷T =160.8×ΔA V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.02mL； V2---反應體系總體積，2×10-4 L； d---96 孔板光徑，0.5cm； ε---NADPH 摩爾消光系數，6.22×103 L/mol/cm； W---樣本質量，g； T---反應時間，20min； Cpr---蛋白濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測定試劑盒。