脯an酸脫氫酶(ProDH)試劑盒,微板法

脯an酸脫氫酶(ProDH)試劑盒,微板法

脯an酸脫氫酶(ProDH)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 脯*酸脫氫酶（PDH）試劑盒說明書 （貨號：WS1011W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 脯*酸脫氫酶(proline dehydragenase，PDH，EC 1.5.1.2) 催化脯*酸生成 Δ1-二氫吡咯- 5-羧酸的反應，是脯*酸降解過程的限速步驟。脯*酸是分布zui廣泛的一種滲透物質，在脅 迫條件下很多植物可以通過增加合成、減少降解而在體內累積大量脯*酸，降低 PDH 活性 對于防止滲透脅迫對植物造成傷害、保護細胞結構等方面具有重要意義。 脯*酸脫氫酶(PDH)催化脯*酸脫氫并使 NAD+還原成 NADH，通過檢測 NADH 在340nm 處的增加速率即可得出 PDH 酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 1.1mL 蒸餾水溶解備用 試劑二 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 1.1mL 蒸餾水溶解備用 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、脯*酸脫氫酶（PDH）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： 稱取約 0.1g 組織樣本，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min， 取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取。 2、上機檢測： 1 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 340nm。 2 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 3 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 40 試劑一 10 試劑二 140 試劑三 10 輕輕混勻，室溫（25℃）下，可先孵育 6min 后于 340nm 處讀取 A1，30min 后讀取 A2，△A=A2-A1。 【注】 1.若△A 的值在零附近，可以適當延長反應時間 T 到 60min 后或更長讀取 A2，改變后的 反應時間需代入計算公式重新計算?；蜻m當增加樣本取樣質量 W，則改變后的反應時 間 T 和樣本質量 W 需代入計算公式重新計算。 2. 若起始值 A1 太大如超過 2（如顏色較深的植物葉片，一般色素較高，則起始值相對本試劑盒僅供科研使用 2 會偏高），可以適當減少樣本加樣量 V1（如減至 20μL，則試劑三相應增加），則改變 后的加樣體積 V1 需代入計算公式重新計算。 或向待測樣本中加少許活性炭混勻靜置 5min 后 12000rpm, 4℃離心 10min，上清液用于檢測； 3．若上升趨勢不穩定，可以每隔 2min 讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時間段 T 參與 計算，相對應的 A 值也代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、按樣本蛋白濃度計算 單位定義：每毫克組織蛋白在每分鐘內生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 PDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(V1×Cpr) ÷T =53.6×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計算 單位定義：每克組織在每分鐘內生成 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 PDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(W× V1÷V) ÷T =53.6×ΔA÷W V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.04mL； V2---反應體系總體積，2×10-4 L； d---96 孔板光徑，0.5cm； ε---NADH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm； W---樣本質量，g； T---反應時間，30min； Cpr---蛋白濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測定試劑盒。