胰蛋bai酶試劑盒-可見顯色法,微板法

胰蛋bai酶試劑盒-可見顯色法,微板法

胰蛋bai酶試劑盒-可見顯色法,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 胰*白酶（Trypsin）試劑盒說明書 (貨號：WS9021W 微板法 96 樣) 一、產品簡介： 胰蛋*酶(EC 3.4.4.4) 是蛋白酶的一種，可以催化水解酰胺鍵。是一種重要的消化酶。 胰*白酶催化水解 N-苯甲酰-DL-精*酸-對硝基苯胺鹽酸鹽(BAPNA)生成對硝基苯胺，后者 在 405nm 有吸收峰，通過測定吸光值升高速率即可得出胰*白酶的活性大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規格 保存條件 備注 試劑一 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體 0.6mL×1 支 -20℃保存 若凝固則可于 37℃水浴至融化。 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重做標曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、可調式移液器、天平、研缽、冰和蒸餾水。 四、胰*白酶活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗樣本 和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織，加入 1mL 生理鹽水，進行冰浴勻漿。4℃×12000rpm 離心 10min，取上清， 置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 ② 細菌/細胞樣本：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細胞加 入 1mL 生理鹽水，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 ③ 液體樣本：若是澄清液體，直接檢測，若液體樣本渾濁，需 4℃×12000rpm，離心 10min， 取上清液檢測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 405nm。 ② 所有試劑解凍至 37℃或 37℃水浴 15-30min。 ③ 反應 mix 制備：試劑二若凝固則可于 37℃水浴至融化，再按照試劑一：試劑二=0.97mL： 0.03mL 混勻成反應 mix，現配現用，用多少量配制多少反應 mix。 ④ 在 96 孔板中依次加入：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 30 反應 mix 170 混勻， 立即于 405nm 處測定吸光值 A1，37℃ 條件下反應 10min 后讀取 A2，ΔA=A2-A1。 【注】若ΔA 在零附近徘徊，可以延長反應時間 T（如延長至 20min 后讀取 A2）或增加樣本量 V1 （如增至 50μL，則反應 mix 相應減少），則改變后的 T 和樣本量 V1 需代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線：y = 0.0259x - 0.001：x 為標準品(nmoL)，y 為ΔA。 2、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織每分鐘催化產生 1nmoL 對硝基苯胺為一個酶活單位（U）。 胰*白酶(nmoL/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.001)÷0.0259]÷(W×V1÷V)÷T=128.7×(ΔA+0.001)÷W 3、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產生 1nmoL 對硝基苯胺為一個酶活單位（U）。 胰*白酶(nmoL/min/mg prot)=[(ΔA+0.001)÷0.0259]÷(V1×Cpr)÷T=128.7×(ΔA+0.001)÷Cpr 4、按細胞數量計算： 單位定義：每 104個細胞每分鐘催化產生 1nmoL 對硝基苯胺為一個酶活單位（U）。 胰*白酶(nmoL/min/104 cell)=[(ΔA+0.001)÷0.0259]÷(500×V1÷V)÷T=0.26×(ΔA+0.001) 5、按照液體體積計算： 單位定義：每毫升液體每分鐘催化產生 1nmoL 對硝基苯胺定義為一個酶活單位（U）。 胰*白酶(nmoL/min/mL)=[(ΔA+0.001)÷0.0259]÷V1÷T=128.7×(ΔA+0.001) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.03 mL； W---樣本質量，g； 500--細菌或細胞總數，500 萬； T---反應時間，10min； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒； 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（10μmol/mL）：臨用前甩幾下或離心，使粉體落入底部，加入 0.1mL 乙 醇，渦旋震蕩溶解后再加入 0.9mL 的蒸餾水混勻，得到 10μmol/mL 備用。 2 用蒸餾水把母液稀釋成以下濃度：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1μmol/mL。也可根據實際來調整濃度。 3 30μL 標準品+170μL 試劑一，混勻后于 405nm 處讀取 A 值，依據結果即可制作標準曲線。