Caspase-3活性測(cè)定試劑盒,微板法

Caspase-3活性測(cè)定試劑盒,微板法

Caspase-3活性測(cè)定試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 Caspase-3 活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書 (貨號(hào)：WS5121W 微板法 48 樣) 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： Caspase-3 又稱 CPP32、Yama 或 apopain，屬于 CED-3 亞家族，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的一 個(gè)關(guān)鍵酶。 利用 Caspase-3 分解底物 Ac-DEVD-pNA 產(chǎn)生黃色的對(duì)硝基苯胺（pNA），后者在 405nm 有吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率即可得出 Caspase-3 酶活性大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存條件 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體 0.5mL×1 支 -20℃保存 低溫放置易凍住，放置室溫使其 解凍成液體再用，用不完的試劑 分裝后-20℃保存。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重做標(biāo)曲則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、天平、研缽、冰和蒸餾水。 四、Caspase-3 活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。4℃×12000rpm 離心 10min，取上 清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提 取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；4℃×12000rpm 離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照數(shù)量（104）：提取液體積(mL)為 500-1000：1 的比例進(jìn)行提取 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 405nm。 ② 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 40 試劑一 150 試劑二 10 混勻，于 405nm 處讀取 A1 值，37℃反應(yīng) 1h 后讀取 A2 值。本試劑盒僅供科研使用 2 【注】：1. 加完試劑二即啟動(dòng)反應(yīng)，所以試劑二加完混勻后立即檢測(cè)，若 A2 值大于 1.5，可減少樣本加 樣量 V1（如減至 10μL，則試劑一相應(yīng)增加），或縮短反應(yīng)時(shí)間 T（如由 1h 減至 30min），則改 變后的 V1 和 T 需代入公式重新計(jì)算。 2. 若ΔA 小于 0.01，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如由 1h 增至 2h 或更長(zhǎng)），則改變后的 T 需代入公式重 新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0291x - 0.0004：x 為標(biāo)準(zhǔn)品（對(duì)硝基苯胺）(nmoL)，y 為ΔA。 2、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每小時(shí)催化底物產(chǎn)生 1nmoL 對(duì)硝基苯胺為一個(gè)酶活單位（U）。 Caspase-3(nmoL/h/g 鮮重)=[(ΔA+0.0004)÷0.0291]÷(W×V1÷V)÷T=859.1×(ΔA+0.0004)÷W 3、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白每小時(shí)催化底物產(chǎn)生 1nmoL 對(duì)硝基苯胺為一個(gè)酶活單位（U）。 Caspase-3 (nmoL/h/mgprot)=[(ΔA+0.0004)÷0.0291]÷(V1×Cpr)÷T=859.1×(ΔA+0.0004)÷Cpr 4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 單位定義：每 104個(gè)細(xì)胞每小時(shí)催化底物產(chǎn)生 1nmoL 對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活單位（U）。 Caspase-3 (nmoL/h/104 cell)=[(ΔA+0.0004)÷0.0291]÷(500×V1÷V)÷T=1.72×(ΔA+0.0004) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.04mL； T---反應(yīng)時(shí)間，1h； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)胞數(shù)量； D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（10μmol/mL）：臨用前甩幾下或離心，使粉體落入底部，加入 0.5mL 乙醇，渦旋震蕩溶解后再加入 0.5mL 的蒸餾水混勻，得到 10μmol/mL 備用。 2 用蒸餾水把母液稀釋成以下濃度：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5μmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際來(lái) 調(diào)整濃度。 3 40μL 標(biāo)準(zhǔn)品+160μL 試劑一，混勻后于 405nm 處讀取 A 值，依據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn) 曲線。 ΔA=A2-A1。