谷an酰胺合成酶(GS)試劑盒,微板法

谷an酰胺合成酶(GS)試劑盒,微板法

谷an酰胺合成酶(GS)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 谷胺酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）試劑盒說明書 （貨號：WS1040W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 谷胺酰胺合成酶（GS，EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物體內氨同化的關鍵酶之一，植物吸收的 無機氮經硝酸還原酶（NR）和亞硝酸還原酶（NIR）還原成 NH4+后，通過谷胺酰胺合成酶（GS）參與的 GS/GOGAT 途徑才能進行氮素的同化和利用。 谷胺酰胺合成酶（GS）在 ATP 和 Mg2+存在下，催化銨離子和谷*酸合成*氨酰胺；谷*酰胺進一步轉 化為γ─谷氨酰基異羥肟酸，在酸性條件下形成的絡合物在 540nm 處有吸收峰，進而得到谷胺酰胺合 成酶（GS）的酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體120mL×1瓶 4℃保存 試劑一 液體 34mL×1 瓶 4℃保存 臨用前 37℃預熱 10min，充分混勻 試劑二 液體 34mL×1 瓶 4℃保存 臨用前 37℃預熱 10min，充分混勻 試劑三 粉劑 mg×2 瓶 -20℃保存 用前甩幾下或 4℃離心使試劑落入試管底 部，每瓶再加入 13mL 蒸餾水充分溶解待 用，仍-20℃保存。 試劑四 液體 45mL×1 瓶 4℃保存 [注]：粉劑量在 mg 級別，使用前用手甩幾次或者進行離心，打開直接加入要求的試劑即可。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、谷胺酰胺合成酶（GS）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。12000rpm，4℃離心 10min，取 上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取。 ② 細菌/細胞樣本： 先收集細菌/細胞到離心管內，離心后棄上清；取 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液； 超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）， 12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例提取。 2、 上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑（μL） 測定管 對照管 樣本 200 200 試劑一 320 試劑二 320本試劑盒僅供科研使用 2 試劑三 120 120 混勻，37℃水浴 30min 試劑四 200 200 混勻，反應 2min，8000rpm，4℃離心 10min，取 200μL 上清液 于 96 孔板中，540nm 處分別讀取吸光值 A，△A=A 測定管-A 對 照管（每個測定管須設一個對應的對照管）。 【注】：若△A 值低于 0.005，可增加樣本加樣體積 V1（如由 200μL 增至 400μL，則試劑一和試 劑二相應減少 120μL，試劑三相應減少 80μL），保持反應總體積不變。或增加樣本取樣 質量 W（由 0.1g 增加到 0.2g 或更高）。則改變后的 V1 和 W 需代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白在每分鐘內使 A540 吸光值變化 0.005 定義為一個酶活力單位。 GS(U/mg prot)=ΔA÷(Cpr×V1)÷0.005÷T =33.3×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織在每分鐘內使 A540 吸光值變化 0.005 定義為一個酶活力單位。 GS(U/g 鮮重)=ΔA÷(W×V1÷V)÷0.005÷T =33.3×ΔA÷W 3、按細菌或細胞密度計算： 單位定義：每百萬細菌或細胞在每分鐘內使 A540 吸光值變化 0.005 定義為一個酶活力單位。 GS(U/104 cell)=ΔA÷0.005÷(500×V1÷V)÷T=0.07×ΔA V----加入提取液體積，1 mL； V1----加入樣本體積，0.2mL； T----反應時間，30 min； W----樣本質量，g； 500----細胞數量，百萬； Cpr----樣本蛋白質濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。