NADH-谷an酸脫氫酶(NADH-GDH)試劑盒微板法

NADH-谷an酸脫氫酶(NADH-GDH)試劑盒微板法

NADH-谷an酸脫氫酶(NADH-GDH)試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 NADH-谷*酸脫氫酶（NADH-GDH）試劑盒說明書 （貨號：WS5040W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 谷*酸脫氫酶廣泛分布于生物體中，在氨同化和轉化成有機氮化合物的代謝中起重要作 用。其輔酶是 NADH 或 NADPH，在動植物種兩種輔酶都有存在，而以 NADH-谷*酸脫 氫酶（EC 1.4.1.2）活力為主。 本試劑盒提供一種快速靈敏的檢測方法，樣品中的 NADH-谷*酸脫氫酶特異性作用于底 物谷*酸并產生 NADH，同時與顯色劑反應生成黃色物質，該物質在 450nm 處有吸收 峰，進而得到 NADH-GDH 的酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、NADH-谷*酸脫氫酶（NADH-GDH）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 ② 細菌/細胞樣本： 先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取 液；超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例進 行提取 ③ 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 450nm。 ② 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 110mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 5mL×1 瓶 4℃保存 濃度為 1M 試劑二 液體 2mL×1 支 4℃保存 試劑三 液體 1mL×1 支 4℃保存 標準品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 試劑名稱（μL） 測定管 提取液 80 試劑一 50 試劑二 20 樣本 40 試劑三 10 混勻，立即 450nm 下讀取 A1 值，15min本試劑盒僅供科研使用 2 【注】：若ΔA 值過小，可以延長反應時間 T（如由 15min 增至 30min 或 1 小時）， 或增加加樣體積 V1（如由 40μL 增至 80μL，則提取液相應減少），則改變 后的 T 和 V1 需要代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線的方程：y = 0.0614x - 0.0064，x 是 NADH 摩爾質量（nmol），y 是ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 NADH-GDH(nmol/min /mg prot)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷(V1×Cpr) ÷T =27.14×(ΔA+0.0064)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 NADH-GDH(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷(W×V1÷V) ÷T =27.14×(ΔA+0.0064)÷W 4、按細菌/細胞密度計算： 單位定義：每 1 萬個細菌/細胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 NADH-GDH(nmol/min /104 cell)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷(500×V1÷V) ÷T =0.0543×(ΔA+0.0064) 5、按液體體積計算： 單位定義：每毫升液體每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 NADH-GDH(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷V1÷T=27.14×(ΔA+0.0064) V---加入提取液體積，1 mL；V1---加入樣本體積，0.04 mL； T---反應時間，15min； W---樣本質量，g； 500---細菌或細胞總數，500 萬； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（1nmol/μL）：向標準品 EP 管里面加入 1.41ml 蒸餾水（母液需在兩 天內用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.2. nmol /μL。也可根 據實際樣本來調整標準品濃度。 3 依據測定管的加樣表操作，根據結果即可制作標準曲線。 后讀取 A2 值。ΔA=A 2-A1。