酸性磷酸酶(ACP)試劑盒,微板法

酸性磷酸酶(ACP)試劑盒,微板法

酸性磷酸酶(ACP)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 酸性磷酸酶（Acid Phosphatase，ACP）活性測定試劑盒說明書 （貨號：WS3090W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 磷酸酶是一種重要的水解酶。酸性磷酸酶（ACP，EC 3.1.3.2）在酸性條件下磷酸酯去 磷酸化。本試劑盒提供一種高靈敏度，簡單，直接的檢測方法，使用磷酸對硝基苯酯（pNPP） 作為底物，生成黃色的產物PNP，該產物在405nm處有吸收峰。通過檢測PNP在405nm 下的增加速率，即可得到酸性磷酸酶（ACP）活性的大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 110mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×2 支 4℃保存 每支臨用前加 1mL 試劑一混 勻，現配現用，一周內用完。 試劑三 液體 3mL×1 支 4℃保存 標準品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、低溫離心機、水浴鍋、可調式移液器、研缽、蒸餾水。 四、酸性磷酸酶（ACP）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，進行冰 浴勻漿，4℃×12000rpm 離心 15min，取上清液待測。 【注】:①若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ②樣本制備，當天準備當天測定。且樣本中應避免酒石酸鹽，氟化物，EDTA，草酸鹽和檸檬 酸鹽等物質，因其對酸性磷酸酶的活性有抑制作用。 ② 細菌/細胞樣本：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或 細胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 ③ 液體樣本：可直接測定，或者適當稀釋后測定。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30 min，設置溫度 37℃，調節波長為 405nm。 ② 所有試劑于 37℃水浴中預熱 30 min。 ③ 在 96 孔板中依次加入下列試劑： 試劑名稱（μL） 測定管 空白管 （只做一次） 樣本 10 試劑一 140 150 試劑二 20 20 混勻，避光反應，37℃水浴或恒溫培養箱孵育 20min 試劑三 30 30 混勻，在 37℃下靜置 5min，立即于 405nm 下讀取吸本試劑盒僅供科研使用 2 光值 A，△A= A 測定-A 空白。 【注】：① 最后一步檢測時，若有結晶析出，需要 37℃復溶再讀取吸光值。 ② 若△A 的值非常低在零附近，可增加樣本量 V1（如增至 20μL，則試劑一相應減少）或 延長反應時間 T（如增至 30min 或更長），則重新調整的 V1 和 T 須代入公式重新計算。 ③ 若△A 的值超過 1，則需要稀釋樣本，稀釋倍數 D 代入計算公式； ④ 若樣本上清液顏色較深且偏黃色可增加樣本自身對照管消除背景色造成的影響，對照管 為：10μL 樣本+140μL 試劑一+20μL 蒸餾水，37℃水浴或恒溫培養箱孵育 20min 后，再 加 30μL 試劑三，37℃下靜置 5min 后于 405nm 讀值，△A=A 測定-A 對照。提醒：若設 定對照管，則可檢測的樣本數量會相應減少，由 96 樣減少為 48 樣。 五、結果計算： 1、標準曲線：y = 51.516x - 0.0018，x 是 PNP 摩爾質量：μmol；y 是△A。 2、按照樣本質量計算： 酶活定義:在 37℃下，每克組織每分鐘水解 1μmol PNPP 產生 PNP 定義為 1 個酶活單位。 ACP (μmol/min/g 鮮重)=[(△A+0.0018)÷51.516]÷(W×V1÷V)÷T×D =0.1×(△A+0.0018)÷W×D 3、按照樣本蛋白濃度計算： 酶活定義:在 37℃下，每毫克蛋白每分鐘水解 1μmol PNPP 產生 PNP 定義為 1 個酶活單位。 ACP(μmol/min/mg prot)=[(△A+0.0018)÷51.516]÷(Cpr×V1)÷T×D =0.1×(△A+0.0018)÷Cpr×D 4、按細菌/細胞數量計算： 酶活定義:在 37℃下，每 104個細胞每分鐘水解 1nmol PNPP 產生 PNP 定義為 1 個酶活單位。 ACP (nmol/min/104 cell)=[(△A+0.0018)÷51.516]×103÷(500×V1÷V)÷T×D =0.194×(ΔA+0.0018)×D 5、按液體體積計算： 酶活定義:在 37℃下，每毫升液體每分鐘水解 1μmol PNPP 產生 PNP 定義為 1 個酶活單位。 ACP 活力(μmol/min/mL)=[(△A+0.0018)÷51.516]÷V1÷T=0.1×(△A +0.0018) W---樣品質量，g； V---提取液體積，1 mL； V1---上清液體積（mL），0.01mL； T---反應時間，20 min。 D---稀釋倍數，未稀釋即為 1； 500---細胞數量，萬； Cpr---上清液蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（10μmol/mL）：向標準品 EP 管里面加入 1.4mL 蒸餾水超聲溶解， 若有結晶析出，需 37℃水浴至*全溶解。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標準品：0, 0.6, 1.2, 1.8, 2.4, 3 μmol/ml。也可根據實際 樣本來調整標準品濃度。 3 依據加樣表操作，根據結果即可制作標準曲線。