土壤N-乙酰-βD氨基葡萄糖苷酶試劑盒微板法

土壤N-乙酰-βD氨基葡萄糖苷酶試劑盒微板法

土壤N-乙酰-βD氨基葡萄糖苷酶試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 土壤 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（S-NAG）試劑盒說明書 （貨號：WS1230W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 土壤 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG，EC 3.2.1.52）是溶酶體中的一種酸性水解 酶，由土壤微生物分泌，該酶的活性變化與機體某些病理狀態密切相關。 土壤 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（S-NAG）分解 4-硝基酚-β-N-乙酰氨基葡萄糖生成 對-硝基*酚（PNP），在 405nm 處檢測該產物的升高速率，來計算 S-NAG 活力大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 試劑一 粉劑 mg×2 瓶 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，每瓶 再加 7.6mL 蒸餾水，充分溶解備用， 用不完的試劑仍-20℃保存； 試劑二 液體 80mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體 80mL×1 瓶 4℃保存 標準品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、水浴鍋或恒溫培養箱、可調式移液器、天平。 四、土壤 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（S-NAG）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本的制備： 取新鮮土樣或干土（風干或者 37 度烘箱風干），先粗研磨，過 40 目篩網備用。 【注】：土壤風干，減少土壤中水分對于實驗的干擾；土壤過篩，保證取樣的均勻細膩； 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 405nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 空白管（僅做一次） 土樣（g） 0.05 0.05 試劑一 150 150 蒸餾水 150 試劑二 300 300 300 混勻， 37℃（水浴鍋或恒溫培養箱）振蕩反應 1h 試劑三 350 350 350 混勻，12000rpm，離心 10min，取上清液 200μL 于 96 孔板中，于 405nm 下讀取吸光值 A，△A=A 測定-A 對照-A 空白（每個測定管 需設一個對照管）。 【注】：1.若ΔA 在零附近徘徊，可延長 37℃的孵育時間 T（如增至 4 小時或更長），或增加 土樣質量 W（如增至 0.2g）。則改變后的 T 和 W 需代入計算公式重新計算。 2.若測定管 A 值大于 1.5 或△A 大于 1.5，可縮短 37℃的孵育時間 T（如減至 0.5 小時或更短）。 則改變后 T 需代入計算公式重新計算。或對最后一步的待檢測上清液（包括測定管、對照管本試劑盒僅供科研使用 2 和空白管）同時用蒸餾水進行稀釋，稀釋倍數 D 代入計算公式。 五、結果計算： 1、標準曲線：y = 0.0959x - 0.0056；x 為標準品質量（μg），y 為吸光值ΔA 。 2、單位定義：每小時每克土樣中產生 1nmol 對-硝基*酚（PNP）定義為一個酶活單位。 S-NAG 活力(nmol/h/g 土樣)=(ΔA+0.0056)÷0.0959÷Mr×103÷W÷T×D =75×(ΔA+0.0056) ÷W×D T---反應時間，1h； W---實際稱取土樣質量，g； Mr--- PNP 相對分子質量，139.11； D---稀釋倍數，未稀釋即為 1。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（1mg/mL）：向標準品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標準品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5mg/mL。也可根據實際 樣本來調整標準品濃度。 3 在 EP 管中依次加入：20μL 標準品+130μL 蒸餾水+300μL 試劑二+350μL 試劑三，混 勻，取 200μL 至 96 孔板中，于 405nm 下讀取吸光值。 4 根據結果制作標準曲線。