土壤gu氨酰胺酶(S-GLS)試劑盒,微板法

土壤gu氨酰胺酶(S-GLS)試劑盒,微板法

土壤gu氨酰胺酶(S-GLS)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 土壤谷*酰胺酶(solid-glutaminase, S- GLS) 測定試劑盒說明書 （貨號：WS4230W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 谷氨*胺酶（GLS，EC 3.5.1.2）是酰胺酶的一種，催化谷*酰胺水解成谷*酸和氨， 在氮素代謝中具有重要調控作用。 土壤中的谷*酰胺酶（S-GLS）催化谷*酰胺水解成 L-谷*酸和氨，利用氨在強堿的 環境下與次氯酸鹽和*酚作用，生成水溶性染料靛酚藍，溶液顏色穩定。其在 630nm 處 有特征吸收峰，通過檢測氨增加的速率，即可計算該酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 試劑一 液體 40mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×2 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，每 瓶再加 11mL 蒸餾水溶解備用。 試劑三 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 12mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 試劑六 A：液體 3.5mL×4 瓶 B：液體μL×1 支 4℃保存 臨用前取30μL 的B 液進一瓶 A 液 中，混勻后作為試劑六使用。混勻 后的試劑六一周內用完。 標準管 液體 mL×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該標曲。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、可調式移液槍、水浴鍋或恒溫培養箱、甲苯和蒸餾水。 四、土壤谷*酰胺酶(S-GLS)活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本的制備： 取新鮮土樣風干或者 37℃烘箱風干，先粗研磨，過 40 目篩網，備用。 【注】：土壤風干，減少土壤中水分對于實驗的干擾；土壤過篩，保證取樣的均勻細膩； 2、上機檢測： ① 培養：取 EP 管依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 土樣（g） 0.1 0.1 甲苯 20 20 振蕩混勻，室溫放置 15min 試劑一 200 200 試劑二 100 混勻，放入 37℃水浴鍋或恒溫培養箱中孵育 2h 試劑三 300 300 試劑二 100 充分混勻，沸水浴（95℃-100℃）10min，室溫 12000rpm 離心 10min， 上清液待測。本試劑盒僅供科研使用 2 ② 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 630nm。 ③ 顯色反應：在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 上清液 15 15 蒸餾水 45 45 試劑四 60 60 試劑五 30 30 試劑六 60 60 充分混勻，37℃放置 20min 后，于 630nm 處讀取吸光值 A， ΔA=A 測定管-A 對照管（每個樣本做一個自身對照）。 【注】1. 試劑四和五和六需分開加，不能事先混勻。 2. 若ΔA 的值較小，可以增加 37℃孵育時間 T（如增至 4 小時或更長），或在顯色反應階段增加上 清液的量 V1(如增至 30μL，則蒸餾水體積相應減少)；則改變后的反應時間 T 和上清液體積 V1 需代入計算公式重新計算。 3. 若 A 測定的值大于 1.5，可以減少 37℃孵育時間 T（如減至 1 小時或更短），或在顯色反應階段 減少上清液的量 V1(如減至 5μL，則蒸餾水體積相應增加)；則改變后的反應時間 T 和上清液體 積 V1 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程為 y = 3.1715x - 0.0164；x 為標準品質量（μg），y 為吸光值ΔA。 2、單位定義：每克土樣每小時催化谷*酰胺生成 1μg 氨定義為一個酶活力單位。 S-GLS(μg/h/g 土樣)=(ΔA+0.0164)÷3.1715×(V÷V1)÷W÷T=6.52×(ΔA+0.0164) ÷W V---反應體系總體積，0.62mL； V1---顯色反應階段上清液體積，0.015mL； T---反應時間，2h； W---土樣質量； 附：標準曲線制作過程： 1 標準品母液（20μg/mL 的氨）： 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標準品：0, 4, 8, 12, 16, 20 μg/mL。也可根據實際樣本 來調整標準品濃度。 3 按照顯色反應階段的測定管加樣體系操作，根據結果即可制作標準曲線。