天冬酰胺合成酶（ASNS)試劑盒,微板法

天冬酰胺合成酶（ASNS)試劑盒,微板法

天冬酰胺合成酶（ASNS)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 天冬酰胺合成酶（Asparagine Synthetase，AS）試劑盒說明書 （貨號：WS9340W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 天冬酰胺合成酶（AS，EC 6.3.5.4) 廣泛存在于植物和微生物體內(nèi)，是一個以氨或谷*酰 胺及天冬氨酸為底物催化合成天冬酰胺的關(guān)鍵酶，該酶對于研究植物營養(yǎng)有重要意義， 天冬酰胺合成酶（AS) 催化谷*酰胺的氨基轉(zhuǎn)移到天冬氨酸形成天冬酰胺，同時生成*氨 酸；利用谷*酸脫氫酶作用于生成的谷*酸，同時使 NAD+還原成 NADH，通過測定 NADH 在 340nm 處的增加速率，進而得出天冬酰胺合成酶活性大小。 該酶催化反應(yīng)：ATP+L-aspartate+L-glutamine+H2O=AMP+diphosphate+L-asparagine+L-glutamate。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，再 加入 12mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 粉體 mg×1 瓶 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，再 加入 12mL 蒸餾水溶解備用。 試劑三 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，再 加入 12mL 蒸餾水溶解備用。 試劑四 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，再 加入 6mL 蒸餾水溶解備用。 試劑五 液體 50mL×1 瓶 4℃保存 試劑六 液體 4mL×1 瓶 4℃保存 試劑七 粉體 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，再 加入 2.2mL 蒸餾水溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、天冬酰胺合成酶（AS）活性檢測： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： 稱取約 0.1g 組織（水分多的樣本取 0.5g），加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。12000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 2、上機檢測： ① 酶標儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 100 100 試劑一 50 50 試劑二 50 50 試劑三 50 50本試劑盒僅供科研使用 2 試劑四 50 試劑五 100 150 混勻，37℃下孵育 20 分鐘 95℃沸水浴 3 分鐘，上下混勻后，12000rpm 離心 5 分鐘， 上清液待測。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 ②歩上清液 80 80 試劑五 90 90 試劑六 20 20 試劑七 10 10 混勻，37℃下孵育 30 分鐘，于 340nm 處讀吸光值 A， △A=A 測定-A 對照（每個樣本需設(shè)一個自身對照 ）。 【注】若△A 差值在零附近，可在③反應(yīng)階段增加上清液（V3）的量（如增加到 120-150μL， 則試劑五相應(yīng)減少）；或延長第②歩中 37℃反應(yīng)時間 T（如由 20min 增加至 40min）； 或增加②歩中樣本加樣體積 V1（如由 100μL 增至 200μL，則試劑五相應(yīng)減少）；則改 變后的 V3 或 T 或 V1 需代入計算公式重新計算。 五、結(jié)果計算： 1、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成 1 nmoL 的 NADH 定義為一個酶活力單位。 AS(nmol NADH/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V4×109]×(V2÷V3)÷(V1×Cpr) ÷T =160.8×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織每分鐘生成 1nmoL 的 NADH 定義為一個酶活力單位。 AS(nmol NADH /min/g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V4×109]×(V2÷V3)÷(W×V1÷V) ÷T =160.8×ΔA÷W V---加入提取液體積，1 mL； V1---②步中加入樣本體積，0.1mL； V2---②步反應(yīng)體系總體積，4×10-4 L； V3---③反應(yīng)階段中上清液，0.8×10-4 L； V4---③步反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L； d---96 孔板光徑，0.5cm； ε---NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/moL/cm； W---樣本質(zhì)量，g； T---反應(yīng)時間，20min； Cpr---蛋白濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測定試劑盒。