二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)試劑盒微板法

二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)試劑盒微板法

二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 植物二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）試劑盒說明書 （貨號：WS2060W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco，EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一個關鍵 酶，既控制著CO2的固定，同時又制約著碳素向Calvin循環和光呼吸循環分流，其活性的 大小直接影響著光合速率。初始活性可反映體內酶的活化狀態，總活性為體內已活化的酶 加上潛在活化的酶活性。 在 Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）與 1 分子的 CO2結合，產生 2 分子的 3-磷酸甘油酸（PGA），在 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的共同作用 下，產生甘油醛-3-磷酸，并使還原型輔酶 I（NADH）氧化。因此，通過檢測 340nm 下 NADH 的下降速率，即可得出 Rubisco 的酶活性大小，為了使 NADH 的氧化和 CO2 的固 定同步。本試劑盒加入了 ATP 再生系統。 二、測試盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×3 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部，每 支分別加 0.74mL 蒸餾水溶解備用。用 不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反 復凍融，三天內用完。 試劑二 液體μL×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底部，再 分別加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑三 粉劑 mg×1 支 4℃保存 試劑四 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 2mL×1 支 -20℃保存 一次性用不完可分裝保存于-20℃。 【注】本試劑盒僅提供 96 個樣本的初始活性檢測或者 96 個樣本的總活性檢測。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、研缽、冰。 四、二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織樣本，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離 心 10min，取上清，置冰上待測。 【注意】 若樣本顏色較深（如植物葉片），可引起起始值 A1 值較大如超過 1.5，可在樣本制備過程中 增加除色素步驟：取約 0.2g 組織（水分充足的樣本可取 1g），加入 1mL 的 80%乙醇冰浴勻漿， 12000rpm，4℃離心 10min，棄掉色素較深的上清液；以上除色素步驟重復 2 次。最后向離心得到 的沉淀中加入 1mL 提取液，混勻或再次冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。 ② 細菌/細胞樣本：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或 細胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，所有試劑解凍至室溫（25℃） ② 提示：一般以檢測初始活性為主。若檢測總活性則該試劑盒從可以檢測 96 個樣本本試劑盒僅供科研使用 2 減少為 48 個樣本。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 初始活性測定管 總活性測定管 樣本 10 10 試劑一 20 20 試劑二 10 10 試劑三 10 10 試劑四 130 130 試劑五 20 混勻，25℃孵育 15min 20 輕輕混勻，室溫（25℃）條件下，于 340nm 處檢測，10s（待反應體 系穩定）時讀取 A1，10 min 后讀取 A2，ΔA=A1-A2。 【注】 1. 初始活性測定管，加完試劑五后立即按照操作說明書檢測；總活性測定管于 25℃孵育 10min 后再加試劑五，再按照操作說明書檢測； 2. 若 10s 后反應體系未穩定可延長到 1min 再讀值。 3. 若△A 值在零附近，可適當延長反應時間 T（如由 10min 延長到 20min 后讀 A2），或增加 樣本加樣量 V1(由 10μL 增至 30μL），則改變后的 T 和 V1 需代入計算公式重新計算。 4. 若 A1 值太大如超過 2（如顏色較深的植物葉片，一般色素較高，則起始值相對會偏高）， 可以適當減少樣本加樣量 V1(由 10μL 減至 5μL），則改變后的 V1 需代入公式重新計算。 5. 若ΔA 值大于 0.4，則需減少反應時間 T（如由 10min 減至 5min），則改變后的 T 需代入計 算公式重新計算。 6. 若下降趨勢不穩定，可以每隔 20S 讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時間段來參與計 算，相對應的 A 值也代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白在每分鐘內氧化 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 Rubisco 活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr) ÷T=643.1×ΔA÷Cpr 單位定義：每毫克組織蛋白在每分鐘內固定 1 nmol CO2定義為一個酶活力單位。 Rubisco 活力(nmol CO2/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷2÷T=321.6×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織在每分鐘內氧化 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 Rubisco 活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=643.1×ΔA÷W 單位定義：每克組織在每分鐘內固定 1 nmol CO2定義為一個酶活力單位。 Rubisco 活力(nmol CO2/min/g 鮮重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷2÷T=321.6×ΔA÷W 3、按細胞數量計算： 單位定義：每 104個細胞每分鐘內氧化 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 Rubisco 活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=643.1×ΔA÷500 V--加入提取液體積，1 mL； V1--加入樣本體積，0.01mL； d--96 孔板光徑，0.5cm； V2--反應體系總體積，2×10-4 L； ε--NADH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm； W--樣本質量， g； 2---每固定 1 nmol CO2有 2 nmolNADH 被氧化； T---反應時間，10min； 500--細胞數量，萬； Cpr---蛋白濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測定試劑盒。