αL阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Af)試劑盒微板法

αL阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Af)試劑盒微板法

αL阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Af)試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Arabinofuranosidase, α-Afa)試劑盒說明書 （貨號：WS4170W 微板法 48 樣） 一、產品簡介： α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-Afa，EC 3.2.1.55）是一種能夠水解非還原呋喃阿拉伯糖殘 基的糖苷酶類，使細胞壁阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖等中性糖不斷解離，促進果膠 的增溶和降解。由于果實成熟過程中常常伴隨著阿拉伯糖的喪失，該酶活性在果實成熟軟 化中的研究具有重大意義。 本試劑盒提供一種簡單，靈敏，快速的測定方法，α-Afa分解對-硝基苯阿拉伯呋喃糖 苷生成對-硝基*酚，后者在405nm有吸收峰，通過測定吸光值升高速率即可得出α-Afa 酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 三、所需的儀器和用品 酶標儀、96 孔板、低溫臺式離心機、水浴鍋、研缽、冰和蒸餾水。 四、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-Afa）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.2g 組織（水分充足的樣本取 0.5g），加入 1mL 提取液，冰浴勻 漿，然后 12000rpm，4℃，離心 10min，取上清作為粗體液，置于冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 ② 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ①酶標儀預熱 30min 以上，溫度設定 37℃，波長設定為 405nm。 ②所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 在 EP 管中依次加入： 【注】：若ΔA 過小，可以延長保溫時間（如：40min 或更長），或增加樣本加樣量 V1(如增至 20μL， 則提取液相應減少)，則改變后的反應時間 T 和加樣體積 V1 需代入計算公式重新計算。 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使試劑粉體落入底部， 再加 1.5mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑二 液體 18mL×1 瓶 4℃保存 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 10 10 試劑一 25 蒸餾水 25 提取液 35 35 迅速混勻，37℃保溫 30min 試劑二 180 180 混勻，取 200μL 至 96 孔板中，于 405nm 處測定吸光 值 A，ΔA=A 測定-A 對照（每個樣本需設一個對照管）。本試劑盒僅供科研使用 2 五、結果計算： 1、標準曲線方程為 y = 0.063x - 0.0015；x 為標準品摩爾質量（nmol），y 為ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計算： 單位的定義：每毫克組織蛋白每分鐘產生 1nmol 對-硝基*酚定義為一個酶活性單位。 α-Afa 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0015) ÷0.063]÷(V1×Cpr)÷T =52.9×(ΔA+0.0015) ÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 單位的定義：每克組織每分鐘產生 1nmol 對-硝基*酚定義為一個酶活性單位。 α-Afa 活性(nmol/min/g 鮮重)= [(ΔA+0.0015) ÷0.063]÷(W×V1÷V)÷T =52.9×(ΔA+0.0015)÷W V----加入提取液體積，1mL； V1----加入反應體系中樣本體積，0.01mL； W----樣本質量，g； T----反應時間，30min； PNP 對分子質量----139.11 Cpr----樣本蛋白質濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（1mg/mL）：向標準品 EP 管里面加入 1ml 蒸餾水。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標準品：0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.2mg/mL。也可根據 實際樣本來調整標準品濃度。 3 在 EP 管加入：10μL 標準品+25μL 蒸餾水+35μL 提取液+180μL 試劑二，混勻，取 200μL 至 96 孔板中，于 405nm 下讀取吸光值。 4 根據結果制作標準曲線。