ATP含量試劑盒,微板法

ATP含量試劑盒,微板法

ATP含量試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 ATP 含量（磷鉬酸比色法）測定試劑盒說明書 （貨號：WS5180W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 三磷酸腺苷（ATP）是生物體內能量轉換最基本的載體,是生物體內最直接的能量來源， 測定 ATP 含量并且計算能荷，能夠反映能量代謝狀態。 肌酸激酶催化三磷酸腺苷（ATP）和肌酸生成磷酸肌酸，用磷鉬酸比色法進行檢測， 經波長掃描產物在 700nm 處有吸收峰，進而計算得到 ATP 的含量。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 提取液A 50mL×1瓶 提取液B 10mL×1瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×2 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉體落入底部，每支再加入 1.1mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復凍融。 試劑二 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 粉劑μg×2 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉體落入底部，每支再加入 0.55mL 蒸餾水溶解待用；用不完的試劑分裝后 -20℃保存，禁止反復凍融。 試劑四 粉劑 mg×2 瓶 4℃保存 臨用甩幾下使粉劑落入底部，每瓶再依次加入 2.86mL 水混勻，最后加 1.14mL 濃硫酸（加濃 硫酸時務必小心，逐滴緩慢加入水中，注意防護）。 試劑五 液體 40mL×1 瓶 4℃保存 標準液 粉體 mg×1 支 -20℃保存 用前準確稱取 2mg 粉體即 ATP 至一新 EP 管中， 再加 1.7mL 蒸餾水溶解即 2μmoL/mL，再用水稀 釋一倍成 1μmoL/mL 標準品，待用(-20℃保存，一 周內用完)。 【注】：全程操作需無磷環境；試劑配置用新的槍頭和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿， 避免磷污染。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、水浴鍋、可調式移液槍、研缽和蒸餾水。 四、ATP 含量檢測： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織加入研缽中，加 0.5mL 提取液 A 進行勻漿，轉至 EP 管中，于 12000rpm，室溫離心 10min，取出 250μL 上清液至一新 EP 管中，再加入適量提取液 B 調 PH 至中性（用 PH 試紙測量，PH 在 6.5-8 之間均可）。再加蒸餾水定容至 0.5mL， 該液體待測備用。 【注】：也可以按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取。 ② 細菌/真菌樣本： 先收集細菌或細胞到離心管內，離心棄上清；取500萬細菌或細胞至研缽中，加0.5mL 提取液 A 進行勻漿，低溫超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔本試劑盒僅供科研使用 2 10s，重復 30 次），于 12000rpm，室溫離心 10min，取出 250μL 上清液至一新 EP 管中， 再加入適量提取液 B 調 PH 至中性（用 PH 試紙測量，PH 在 6.5-8 之間均可）。再加蒸 餾水定容至 0.5mL，該液體待測備用。 ③ 液體樣本： 澄清樣本直接檢測，若渾濁則 12000rpm，4℃離心 5min 后取上清液測定。 【注】：也可以按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30 min 以上，調節波長到 700nm。 ② 反應液配制：按照試劑四：試劑五=1：5 的比例混勻。用多少配多少的混合液。 ③ 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱(μL) 測定管 對照管 標準管 （僅做一次） 空白管 （僅做一次） 樣本 20 20 標準液 20 試劑一 20 20 試劑二 50 50 50 50 試劑三 10 10 蒸餾水 30 50 充分混勻，37℃準確水浴 30min 反應液 180 180 180 180 混勻，37℃水浴 20min，液體全部轉移至 96 孔板中，在 700nm 下 讀取各管吸光值 A（每個測定管需設一個對照管）。 【注】若 A 測定-A 對照的值小于 0.01，可增加取樣質量 W（如增至 0.2g）或增加樣本加 樣量 V1（如由 20μL 增至 50μL，則試劑二相應減少）；標準管仍為 20μL，其他試劑不變； 則改變后的 W 和 V1 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、按樣本鮮重計算： ATP 含量(μmol/g 鮮重)=[C 標準×V 標×(A 測定-A 對照)÷(A 標準-A 空白)]÷(W×V1÷V) =(A 測定-A 對照)÷(A 標準-A 空白)÷W 2、按細菌/細胞密度計算： ATP 含量(nmol/104 cell)=[C 標準×V 標×(A 測定-A 對照)÷(A 標準-A 空白)]÷(500×V1÷V)×103 =2×(A 測定-A 對照)÷(A 標準-A 空白) 3、液體中 ATP 含量計算： ATP 含量(μmol/mL)=[C 標準×V 標×(A 測定-A 對照)÷(A 標準-A 空白)]÷V1 =(A 測定-A 對照)÷(A 標準-A 空白) C 標準---標準液濃度，1μmol/mL； V---加入提取液體積，1mL； V1---加入反應體系中樣本體積，0.02mL； V 標---標準品加樣體積，0.02mL； W---樣本質量，g； 500---細胞或細菌總數，萬。