Super Fluor 488

Super Fluor 488

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一．實驗步驟

1.1 蛋白溶解：用0.1 M NaHCO3 溶解至終濃度為2mg/mL 

將1mL 去離子水加入84mg NaHCO3 瓶中，配成1M 的碳酸氫鈉溶液。振蕩或吹打至*溶解。該溶液pH 約8.3，2～6℃保存可用2個星期；若抗體是溶液，將抗體稀釋至2mg/mL，再加入1/10 體積的上述碳酸氫鈉溶液；若抗體是凍干粉，將1M 碳酸氫鈉溶液用10 倍去離子水稀釋成0.1M 后，用其將抗體溶成2mg/mL 的溶液。

1.2 染料溶解：染料固體粉末從冰箱放入干燥器中慢慢升至常溫后，用無水DMSO將染料配置濃度為1 mg/mL。

1.3 標記：在1mL蛋白溶液中緩慢加入適量染料溶液，（蛋白:染料摩爾比=1:20～50；質量比可在以下范圍內優化 10～200ug Super dye每毫克IgG抗體）。同時在暗處常溫緩慢攪拌1小時。也可以直接將蛋白溶液直接加入染料的固體粉末的試劑瓶中，同時在暗處常溫緩慢攪拌1小時。

1.4 純化：選擇下面三種方式純化后，產品冷凍干燥成粉末或在0.01 M PBS/2mM 溶液中，-20℃避光儲存。

1.4.1 透析法：

1）簡單純化可用100 mL 0.15 M NaCl 溶液常溫避光透析4次,每次4小時除去未標記上的染料。 

2）在4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析過夜。  

3）用100 mL 0.01 M PBS/ 0.01% 溶液常溫避光透析4小時, 在4°C常溫避光再次透析過夜。 

4）用0.22 μm注射器過濾頭過濾抗體溶液。

1.4.2 P-30柱子

1）0.5g p-30凝膠加入9mLPBS（pH=7.4）室溫過夜放置；次日，棄上清；真空抽濾5min。

2）加入9mLPBS，輕柔震蕩均勻，放置20min后，去除上清液。

3）再重復2）。

4）將樹脂柱放入一個13×100mm 的玻璃管柱中，每個柱子加入1.5mL（不要多加），填的要均勻不能有氣泡。具體方法是：攪動純化樹脂（組分C），加入1.0mL 懸浮液至空柱中靜置；全部下沉后再加入0.5mL樹脂至床體積為～1.5mL蓋上蓋子，可以室溫保存。

5) 將樹脂柱上下端的口打開，放入10mL離心管中由于重力水自然流下，用垂直轉子1100g 離心3min，rpm 與相對離心力g 的換算公式如下：相對離心力g=(1.12×10-5)(rpm)2(半徑cm)；離心后靜置待緩沖液全部流出，棄去緩沖液，保留收集管（若沒有垂直轉子，角轉子也可）。

6) 換上干凈的離心管，將標記的蛋白反應液200μL逐滴加入樹脂柱的中心部位，使溶液被吸入膠床中；

7) 將樹脂柱放入空的收集管中，1100g 離心5min；

8）離心后，收集管內是標記好的蛋白，溶在100μLPBS 中，pH7.2，包括2mM 的疊氮鈉。未結合的染料保留在柱中，棄去樹脂柱。

注意事項：配置柱子時，用較細的小瓶，每個小瓶配置2個柱子。便于去除水分。填柱子時，加到1.5mL，盡量不要多加，離心時間按照說明書1000g/3min，不要隨便更改。