葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)試劑盒,微板法

葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)試劑盒,微板法

葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 

 葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase)活性測定試劑盒說明書

(貨號：WS7550W 微板法 96 樣) 

一、產(chǎn)品簡介： 葡萄糖-6-磷酸酶（(glucose 6 phosphatase，G6Pase，EC 3.1.3.9）主要存在于肝臟、腎 臟、 小腸粘膜細(xì)胞、胰島細(xì)胞中，催化 6-磷酸葡萄糖水解為葡萄糖的關(guān)鍵酶，該反應(yīng)是糖原 分解和糖異生的最后一步反應(yīng)。在保證血糖的動(dòng)態(tài)平衡方面起著重要的作用。 本試劑盒提供一種簡單，靈敏，快速的測定方法：G6Pase 催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄 糖，變旋酶和葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步依次催化 NAD+還原生成 NADH，NADH 與一種顯色 探針反應(yīng)生成有色物質(zhì)，通過檢測該有色物質(zhì)的增加速率即可計(jì)算出 G6Pase 酶活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下使粉劑落入底部， 再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解， 試劑二 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下使粉劑落入底部， 再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解， 試劑三 液體μL×1 支 -20℃保存 用前甩幾下使液體落入底部， 再加 1mL 蒸餾水充分溶解， 試劑四 液體 1mL×1 支 4℃保存 試劑五 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase)活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。12000rpm 4℃離心 15min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌 或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間 隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm 4℃離心 15min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，設(shè)置溫度 25℃,調(diào)節(jié)波長至 450nm。 ② 試劑解凍至室溫（25℃）；若一次檢測樣本數(shù)較多，可將試劑一和二和三等比例混勻 后再一起加 30μL，其他試劑加樣量不變 ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 10 試劑一 10 試劑二 10本試劑盒僅供科研使用 2 試劑三 10 試劑四 10 試劑五 150 混勻，25℃條件下，立即于 450nm 處讀取 A1 值，20min 后讀取 A2 值，（觀察：酶活性越大， 則黃色越明顯）。ΔA=A2-A1。 【注】：1.若ΔA 過小，可以延長反應(yīng)時(shí)間（如：60min 或更長）再讀取 A2， 或增加樣本加樣體積 V1（如增至 30μL，則試劑五相應(yīng)減少），則改 變后的反應(yīng)時(shí)間 T 和加樣體積 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2.若樣本自身含有較高水平葡萄糖，為了消除樣本自身的背景值，需增設(shè)一個(gè)樣本 自身對照，即對照管換成 10μL 的煮沸樣本（95-100℃煮沸 10min,室溫離心，取上 清液測定），其他不變。ΔA= A2 測定- A2 對照。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.077x - 0.001；x 是 NADH 摩爾質(zhì)量（nmol），y 是ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化 1 nmolNAD+生成 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活單位。 G6Pase(nmol/min /mg prot)=[(ΔA+0.001)÷0.077]÷(V1×Cpr)÷T=64.94×(ΔA+0.001)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每分鐘催化 1 nmolNAD+生成 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活單位。 G6Pase(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.001)÷0.077]÷(W×V1÷V)÷T=64.94×(ΔA+0.001)÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 單位定義：每 1 萬個(gè)細(xì)胞/細(xì)胞每分鐘催化 1nmolNAD+生成 1nmol NADH 定為一個(gè)酶活單位。 G6Pase(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.001)÷0.077]÷(500×V1÷V)÷T=0.13×(ΔA+0.001) V----加入提取液體積，1 mL； V1----加入樣本體積，0.01mL； W----樣本質(zhì)量，g。 T----反應(yīng)時(shí)間，20 min； Cpr----樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1nmol/μL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1.41mL 蒸餾水（母液需在 兩天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. nmol/μL。也可根據(jù)實(shí)際 樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 按照 10μL 標(biāo)準(zhǔn)品+10μL 試劑四+180μL 試劑五加樣體系操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo) 準(zhǔn)曲線。