β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)試劑盒

β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)試劑盒

β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 

β-1,3 葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，β-1,3-GA）試劑盒說明書 

（貨號(hào)：WS6250F 分光法 48 樣） 

一、產(chǎn)品簡介： β-1,3 葡聚糖酶（β-1,3-GA，EC 3.2.1.39)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷鍵水解， 進(jìn)而破壞真菌細(xì)胞壁，特別是與幾丁質(zhì)酶的協(xié)同作用下，可明顯抑制真菌的生長。在植物 染病或處于其他逆境條件下，可誘導(dǎo)細(xì)胞大量合成β-1,3-GA，以增強(qiáng)植物體對(duì)不良外界刺 激產(chǎn)生抗性反應(yīng)，因此β-1,3-GA 活性測(cè)定廣泛應(yīng)用于植物病理和逆境生理研究。 β-1,3-GA 水解昆布多糖的β-1,3-葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生還原末端。利用 3,5 二硝基水楊酸測(cè) 定還原糖的量，在 540nm 讀取吸光值，進(jìn)而得出β-1,3 葡聚糖酶的活性。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×1 瓶 4℃保存 用前加入 3mL 試劑一，充分溶解待 用；用不完的試劑 4℃保存； 試劑三 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、可調(diào)試移液器、臺(tái)式離心機(jī)、水浴 鍋、移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、β-1,3 葡聚糖酶（β-1,3-GA）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.2g 組織（水分充足的樣本可取 1g），加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷的 95%乙醇冰浴勻漿， 4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀，向沉淀中加入經(jīng)預(yù)冷的 80%乙醇混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀。再向沉 淀中加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷提取液，渦旋混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 10min； 留上清，棄沉淀。上清液置冰上待測(cè)。 ② 細(xì)菌/真菌樣本： 先收集細(xì)菌/真菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)菌/真菌加入 1mL 提取液； 冰浴超聲波破碎細(xì)菌/真菌（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 [注]：也可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取） ③ 液體樣本：直接檢測(cè)。若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 可見分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 540nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 在 EP 管中依次加入下列試劑： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 20 煮沸樣本* 20本試劑盒僅供科研使用 2 試劑二 20 20 充分混勻，放入 37℃水浴 30 min 試劑三 300 300 混勻，95℃水浴 5min（可用封口膜纏緊，防止水分散失），流水冷卻至室溫 蒸餾水 560 560 混勻，全部液體轉(zhuǎn)移至 1mL 玻璃比色皿中，540nm 處記錄各管吸光值 A， ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照（每個(gè)測(cè)定管對(duì)應(yīng)一個(gè)對(duì)照管）。 【注】：1.煮沸樣本*：將同一個(gè)樣本在沸水（98-100℃）中煮沸 15 分鐘，以將酶徹di滅活。 再 12000rpm，4℃離心 10min；上清液備用。 2.若ΔA 很小在零附近徘徊，可在樣本制備時(shí)加大取樣質(zhì)量 W（由 0.2g 增加到 0.5g 等），或增加樣本加樣量 V1（由 20μL 增加到 100μL，相應(yīng)的蒸餾水減少，保持 總體積 900μL 不變），或延長 37℃水浴時(shí)間 T（由 30min 增至 60min），則改變 后的 W 和 V1 和 T 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 6.6714x - 0.0341；x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（mg），y 為ΔA。 2、按蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘分解昆布多糖產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活性單位。 β-1,3-GA(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0341)÷6.6714×103]÷(V1×Cpr) ÷T=250×(ΔA+0.0341)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 酶活定義：每克組織每分鐘分解昆布多糖產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活性單位。 β-1,3-GA(μg/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0341)÷6.6714×103]÷(W×V1÷V) ÷T=250×(ΔA+0.0341)÷W 4、按細(xì)菌/真菌密度計(jì)算： 酶活定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或真菌每分鐘分解昆布多糖產(chǎn)生1μg葡萄糖定義為一個(gè)酶活性單位。 β-1,3-GA(μg/min /104 cell)=[(ΔA+0.0341)÷6.6714×103]÷(500×V1÷V) ÷T=0.5×(ΔA+0.0341) 5、按液體體積計(jì)算： 酶活定義：每毫升樣本每分鐘分解昆布多糖產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活性單位。 β-1,3-GA(μg/min/mL)=[(ΔA+0.0341)÷6.6714×103]÷V1÷T=250×(ΔA+0.0341) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，20μL =0.02mL； T---30min； W---樣本鮮重，g； 500---細(xì)菌/真菌總數(shù)，500 萬； 葡萄糖分子量---180.16； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（10mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 2, 4, 6, 8, 10. mg/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來 調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)測(cè)定管的加樣表（標(biāo)準(zhǔn)品替換樣本，且試劑二換成蒸餾水）操作，根據(jù)結(jié)果即本試劑盒僅供科研使用 可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 3