β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)試劑盒,微板法

β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)試劑盒,微板法

β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 

β-1,3 葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，β-1,3-GA）試劑盒說明書 

（貨號：WS6250W 微板法 96 樣）

一、產品簡介： β-1,3 葡聚糖酶（β-1,3-GA，EC 3.2.1.39)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷鍵水解， 進而破壞真菌細胞壁，特別是與幾丁質酶的協同作用下，可明顯抑制真菌的生長。在植物 染病或處于其他逆境條件下，可誘導細胞大量合成β-1,3-GA，以增強植物體對不良外界刺 激產生抗性反應，因此β-1,3-GA 活性測定廣泛應用于植物病理和逆境生理研究。 β-1,3-GA 水解昆布多糖的β-1,3-葡萄糖苷鍵，產生還原末端。利用 3,5 二硝基水楊酸測 定還原糖的量，在 540nm 讀取吸光值，進而得出β-1,3 葡聚糖酶的活性。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 8mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×1 瓶 4℃保存 用前加入 4.5mL 試劑一，充分溶解 待用；用不完的試劑 4℃保存； 試劑三 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 標準品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、可調試移液器、臺式離心機、水浴鍋、移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、β-1,3 葡聚糖酶（β-1,3-GA）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.2g 組織（水分充足的樣本可取 1g），加入 1mL 經預冷的 95%乙醇冰浴勻漿， 4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀，向沉淀中加入經預冷的 80%乙醇混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀。再向沉 淀中加入 1mL 經預冷提取液，渦旋混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 10min； 留上清，棄沉淀。上清液置冰上待測。 ② 細菌/真菌樣本： 先收集細菌/真菌到離心管內，離心后棄上清；取 500 萬細菌/真菌加入 1mL 提取液； 冰浴超聲波破碎細菌/真菌（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 12000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：也可按照細菌或細胞數量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取） ③ 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入下列試劑： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 20 煮沸樣本* 20 試劑二 20 20本試劑盒僅供科研使用 2 充分混勻，放入 37℃水浴 30 min 試劑三 300 300 混勻，95℃水浴 5min（可用封口膜纏緊，防止水分散失），流水冷卻至室溫 蒸餾水 560 560 混勻，取 200μL 至 96 孔板中，540nm 處記錄各管吸光值 A， ΔA=A 測定-A 對照（每個樣本一個對照管）。 【注】：1.煮沸樣本*：將同一個樣本在沸水（98-100℃）中煮沸 15 分鐘，以將酶徹di滅活， 再 12000rpm，4℃離心 10min；上清液備用。 2.若ΔA 很小在零附近徘徊，可在樣本制備時加大取樣質量 W（由 0.2g 增加到 0.5g 等），或增加樣本加樣量 V1（由 20μL 增加到 100μL，相應的蒸餾水減少，保持 總體積 900μL 不變），或延長 37℃水浴時間 T（由 30min 增至 60min），則改變 后的 W 和 V1 和 T 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y = 4.4558x - 0.0362；x 為標準品質量（mg），y 為ΔA。 2、按蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘分解昆布多糖產生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-GA(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0362)÷4.4558×103]÷(V1×Cpr) ÷T=374×(ΔA+0.0362)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 酶活定義：每克組織每分鐘分解昆布多糖產生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-GA(μg/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0362)÷4.4558×103]÷(W×V1÷V) ÷T=374×(ΔA+0.0362)÷W 4、按細菌/真菌密度計算： 酶活定義：每1萬個細菌或真菌每分鐘分解昆布多糖產生1μg葡萄糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-GA(μg/min/104 cell)=[(ΔA+0.0362)÷4.4558×103]÷(500×V1÷V) ÷T=0.75×(ΔA+0.0362) 5、按液體體積計算： 酶活定義：每毫升樣本每分鐘分解昆布多糖產生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-GA(μg/min/mL)=[(ΔA+0.0362)÷4.4558×103]÷V1÷T=374×(ΔA+0.0362) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，20μL =0.02mL；T---30min； W---樣本鮮重，g； 500---細菌/真菌總數，500 萬； 葡萄糖分子量---180.16； Cpr---樣本蛋白質濃，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（10mg/mL）：向標準品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 2, 4, 6, 8, 10. mg/mL。也可根據實際樣本來 調整標準品濃度。 3 依據測定管的加樣表（標準品替換樣本，且試劑二換成蒸餾水）操作，根據結果即 可制作標準曲線。