幾丁質外切酶試劑盒

幾丁質外切酶試劑盒

幾丁質外切酶試劑盒說明書 

（貨號：WS7450F 分光法 24 樣）

一、產品簡介： 多種微生物、動物、植物等都可產生幾丁質酶，高等植物本身不存在作為真菌細胞壁 組分之一的幾丁質，但當植物受到病原菌感染時，幾丁質酶活性迅速提高。因此該酶與 植物對病原微生物的抗性有關，是重要的病程相關蛋白。 幾丁質酶主要水解幾丁質多聚體中β-1,4-糖苷鍵。依據水解位置的不同可分為幾丁質 內切酶和幾丁質外切酶，幾丁質外切酶作用于幾丁質后，生成 N-乙酰氨基葡萄糖單體， 進一步與鐵氰化jia反應，于 420nm 處檢測，進而計算得到幾丁質外切酶活性大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 7mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部， 再加 2.5mL 鹽酸充分混勻溶解 后，再加 2.8mL 蒸餾水混勻備用。 試劑三 液體 14mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉體 g×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部， 再加 30mL 蒸餾水溶解備用。 標準品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、天平、水浴鍋、低溫離心機、鹽酸。 四、幾丁質外切酶活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿，于 4℃，12000rpm 離心 10min，取上清置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照提取液體積(mL) ：組織質量（g）為 1：5~10 的比例進行提取 ② 真菌樣本：先收集細胞到離心管內，離心后棄上清；取 500 萬細胞加入 1mL 提取液； 冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；于 4℃， 12000rpm 離心 10min，取上清置于冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照提取液（mL）：細細胞數量（104）為 1：500~1000 的比例進行提取 2、上機檢測： ① 可見分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 420nm，蒸餾水調零。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（µL） 測定管 對照管 樣本 120 煮沸的樣本 120 試劑一 80 80 試劑二 100 100 混勻，37℃（恒溫培養箱）孵育 1.5h 后,4000rpm 離心 5min，取上清本試劑盒僅供科研使用 2 ③ 在 EP 管中依次加入： 上清液 200 200 試劑三 270 270 混勻，4000rpm 離心 5min，取上清液待測 ④ 在 EP 管中依次加入： 上清液 360 360 試劑四 480 480 混勻，95-100℃煮沸 8min，取全部液體至 1mL 比色皿中于 420nm 處 讀取各管吸光值 A，ΔA＝A 對照-A 測定（每個樣本做一個自身對照）。 【注】1. 煮沸的樣本：于 95-100℃煮沸 10min，使樣本里面的酶失去活性。 2. 若ΔA 較小，可以加大樣本量（如增至 140µL，則試劑一相應減少），或增加樣本取樣量 （如 0.2g），則改變后的 V1 和樣本 W 需代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、 標準曲線方程：y = 0.0248x + 0.0024，X 是標準品質量（μg），y 是ΔA。 2、按照樣本重量計算： 定義：每克組織每小時分解幾丁質產生 1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個單位。 幾丁質外切酶活性(μg/h/g 鮮重)=[(ΔA-0.0024)÷0.0248×1.96]÷(V1÷V×W)÷T =439.1×(ΔA-0.0024)÷W 3、按照蛋白質濃度計算： 定義：每毫克蛋白每小時分解幾丁質產生 1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個單位。 幾丁質外切酶活性(μg/h/mg prot)=[(ΔA-0.0024) ÷0.0248×1.96]÷(V1×Cpr)÷T =439.1×(ΔA-0.0024)÷Cpr 4、按細胞數量計算： 定義：每 104個細胞每小時分解幾丁質產生 1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個單位。 幾丁質外切酶活性(μg/h/104 cell)=[(ΔA-0.0024) ÷0.0248×1.96]÷(V1÷V×細胞數量) =439.1×(ΔA-0.0024)÷細胞數量 V---加入提取液體積，1mL； V1---樣本體積，0.12mL； T---反應時間，1.5h； 1.96---體積系數； W---樣本質量，g； 標準品分子量---221.21； Cpr---樣本蛋白濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（1mg/mL）：標準品臨用前加 2mL 蒸餾水，即為 1mg/mL。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標準品：0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1mg/mL。 3 依據第④步驟的加樣體系：360μL 標準品+480μL 試劑六，混勻，95-100℃煮沸 10min，取全部液 體至 1mL 比色皿中于 420nm 處讀取各管吸光值 A，標準品的質量作為橫坐標，0 mg/mL 對應的 A 值減去各濃度標準品對應的 A 之差作為縱坐標，即可得出標準曲線。