α-葡萄糖苷酶(α - GC)試劑盒,微板法

α-葡萄糖苷酶(α - GC)試劑盒,微板法

α-葡萄糖苷酶(α - GC)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase, α-GC）試劑盒說明書 （貨號：WS1250W 微板法 48 樣） 一、產品簡介： α-葡萄糖苷酶（α-GC，EC 3.2.1.20) 又叫α-D-葡萄糖苷水解酶，廣泛分布于動植物和微生物中，是一 類能夠從含有α-糖苷鍵底物的非還原端催化水解 a-1,4-糖苷鍵，釋放出葡萄糖，或將游離出的葡萄糖殘基 轉移到另一糖類底物形成α-1，6 糖苷鍵，從而得到低聚異麥芽糖或糖酯、糖肽等物質。α-葡萄糖苷酶與 淀粉及糖原等糖代謝密切相關，對維持生物體的正常生理功能起著重要作用。 α-葡萄糖苷酶可以水解對-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成對-硝基*酚，后者在 405nm 有吸收峰， 通過測定吸光值升高速率來計算α-葡萄糖苷酶活性。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，再加 2.5mL 蒸餾水溶解，4℃保存。 試劑二 液體 8mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體32mL×1瓶 4℃保存 標準品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、α-葡萄糖苷酶（α-GC）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本取 0.5g），加入 1mL 提取液，進行冰浴 勻漿。15000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 ② 細菌或細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細 胞，加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s， 間隔 10s，重復 30 次）；15000 rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例 進行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 405nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 10 10 試劑一 40 蒸餾水 40 試劑二 50 50 迅速混勻，37℃保溫 30min本試劑盒僅供科研使用 2 試劑三 300 300 混勻， 取 200μL 至 96 孔板中，405nm 處測定吸光值 A， ΔA=A 測定-A 對照（每個測定管需設一個對照管）。 【注】若ΔA 較小，可以增加 37℃保溫反應時間（如 1 小時）,或者增加樣本上樣量 V1（如增至 30μL， 則試劑二相應減少），則改變后的反應時間 T 或加樣體積 V1 需重新代入計算公式計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y = 0.029x - 0.0143；x 是 PNP 摩爾質量（nmol）， y 是△A。 2、按樣本蛋白濃度計算： 定義：每毫克組織蛋白每分鐘產生 1nmol 對-硝基*酚（PNP）定義為一個酶活性單位。 α-GC 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0143) ÷0.029]÷(V1×Cpr)÷T=114.9×(ΔA+0.0143)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 定義：每克組織每分鐘產生 1nmol 對-硝基*酚（PNP）定義為一個酶活性單位。 α-GC 活性(nmol/min/g 鮮重)= [(ΔA+0.0143) ÷0.029]÷(W×V1÷V)÷T=114.9×(ΔA+0.0143) ÷W 4、按細菌或細胞密度計算： 定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產生 1nmol 對-硝基*酚（PNP）定義為一個酶活性單位。 α-GC 活性(nmol/min/104cell) = [(ΔA+0.0143) ÷0.029]÷(500×V1÷V)÷T =0.23×(ΔA+0.0143) 5、按液體體積計算： 定義：每毫升樣本每分鐘產生 1nmol 對-硝基*酚（PNP）定義為一個酶活性單位。 α-GC 活性(nmol/min/mL)= [(ΔA+0.0143) ÷0.029]÷V1÷T=114.9×(ΔA+0.0143) V----加入提取液體積，1mL； V1----加入反應體系中樣本體積，10μL=0.01mL； W----樣本質量，g； 500----細胞或細菌總數，500 萬； T----反應時間，30min； PNP 對分子質量----139.11； Cpr----樣本蛋白質濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（1mg/mL）：向標準品 EP 管里面加入 1ml 蒸餾水。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標準品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5mg/mL。也可根據實際 樣本來調整標準品濃度。 3 在 EP 管加入：10μL 標準品+40μL 蒸餾水+50μL 試劑二+300μL 試劑三，混勻，取 200μL 至 96 孔板中，于 405nm 下讀取吸光值。 4 根據結果制作標準曲線。