α-葡萄糖苷酶(α - GC)試劑盒

α-葡萄糖苷酶(α - GC)試劑盒

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本試劑盒僅供科研使用 1 α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase, α-GC）試劑盒說明書 （貨號：WS1250F 分光法 24 樣） 一、產(chǎn)品簡介： α-葡萄糖苷酶（α-GC，EC 3.2.1.20) 又叫α-D-葡萄糖苷水解酶，廣泛分布于動植物和微生物中，是一 類能夠從含有α-糖苷鍵底物的非還原端催化水解 a-1,4-糖苷鍵，釋放出葡萄糖，或?qū)⒂坞x出的葡萄糖殘基 轉(zhuǎn)移到另一糖類底物形成α-1，6 糖苷鍵，從而得到低聚異麥芽糖或糖酯、糖肽等物質(zhì)。α-葡萄糖苷酶與 淀粉及糖原等糖代謝密切相關(guān)，對維持生物體的正常生理功能起著重要作用。 α-葡萄糖苷酶可以水解對-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成對-硝基*酚，后者在 405nm 有吸收峰， 通過測定吸光值升高速率來計(jì)算α-葡萄糖苷酶活性。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，再加 2.5mL 蒸餾水溶解，4℃保存。 試劑二 液體 8mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體32mL×1瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、 研缽、冰。 四、α-葡萄糖苷酶（α-GC）活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本取 0.5g），加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴 勻漿。15000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌或細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì) 胞，加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s， 間隔 10s，重復(fù) 30 次）；15000 rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例 進(jìn)行提取。 3 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機(jī)檢測： ① 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 405nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 20 20 試劑一 80 蒸餾水 80 試劑二 100 100 迅速混勻，37℃保溫 30min本試劑盒僅供科研使用 2 試劑三 600 600 混勻， 全部液體轉(zhuǎn)移至 1mL 玻璃比色皿中，405nm 處測定吸 光 A，ΔA=A 測定-A 對照（每個測定管需設(shè)一個對照管）。 【注】若ΔA 較小，可以增加 37℃保溫反應(yīng)時間（如 1 小時）,或者增加樣本上樣量（如增至 60μL， 則試劑二相應(yīng)減少），則改變后的反應(yīng)時間 T 或加樣體積 V1 需重新代入計(jì)算公式計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0237x - 0.0206；x 是 PNP 摩爾質(zhì)量（nmol），y 是△A。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 定義：每毫克組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基*酚（PNP）定義為一個酶活性單位。 α-GC 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0206) ÷0.0237]÷(V1×Cpr)÷T= 70.32×(ΔA+0.0206)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 定義：每克組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基*酚（PNP）定義為一個酶活性單位。 α-GC 活性(nmol/min/g 鮮重)= [(ΔA+0.0206) ÷0.0237]÷(W×V1÷V)÷T=70.32×(ΔA+0.0206) ÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基*酚（PNP）為一個酶活性單位。 α-GC 活性(nmol/min/104cell) = [(ΔA+0.0206) ÷0.0237]÷(500×V1÷V)÷T =0.14×(ΔA+0.0206) 5、按液體體積計(jì)算： 定義：每毫升樣本每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基*酚（PNP）定義為一個酶活性單位。 α-GC 活性(nmol/min/mL)= [(ΔA+0.0206) ÷0.0237]÷V1÷T=70.32×(ΔA+0.0206) V----加入提取液體積，1mL； V1----加入反應(yīng)體系中樣本體積，20μL=0.02mL； W----樣本質(zhì)量，g； 500----細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬； T----反應(yīng)時間，30min； PNP 對分子質(zhì)量----139.11； Cpr----樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1ml 蒸餾水。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5mg/mL。也可根據(jù)實(shí)際 樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 在 EP 管中依次加入：20μL 標(biāo)準(zhǔn)品+80μL 蒸餾水+100μL 試劑二+600μL 試劑三，混 勻，全部液體轉(zhuǎn)移至 1mL 玻璃比色皿中，于 405nm 下讀取吸光值。 4 根據(jù)結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。