蔗糖合成酶SS-Ⅱ(合成方向)試劑盒

蔗糖合成酶SS-Ⅱ(合成方向)試劑盒

蔗糖合成酶SS-Ⅱ(合成方向)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 蔗糖合成酶（合成方向；SS-Ⅱ）試劑盒說明書 （貨號：WS2150F 分光法 24 樣） 一、產品簡介： 蔗糖是重要的光合產物，是植物體內運輸的主要物質，優勢碳水化合物的暫貯形式之一。 蔗糖合成酶（Sucrose Synthase，EC 2.4.1.13）是雙向反應酶，既可催化蔗糖合成又可催化 蔗糖分解，是蔗糖代謝的關鍵酶之一。研究其合成方向 SS-Ⅱ的活性對于植物蔗糖合成具 有重要意義。 SS-Ⅱ催化游離果糖與葡萄糖供體 UDPG 反應生成蔗糖，采用蔗糖與間苯*fen反應生成 的有顏色產物在 480nm 下有特征吸收峰，酶活力大小與顏色深淺成正比。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 30 mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 2.1 mL×1 支 -20℃保存 試劑二 液體 1mL×1 支 4℃保存 試劑三 液體 20 mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉劑 mg×2 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，每 瓶加入 4mL 蒸餾水充分溶解，現配 現用，一周內用完。 標準品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1 mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋、臺式離心機、移液器、研缽。 四、蔗糖合成酶（SS-Ⅱ）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織（水分充足樣本可取 0.5g），加 1mL 提取液，在 4oC 或冰浴進行勻 漿(或使用各類常見電動勻漿器)。4oC 約 12,000rpm 離心 10min，取上清作為待測樣品。 【注意】 若樣本含糖量高，可引起 A 對照值較大如超過 1.6，即檢測背景值過高會影響檢測，可在樣本 制備過程中增加除糖步驟：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 經預冷的 95%乙醇 冰浴勻漿，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀，向沉淀中加入經預冷的 80% 乙醇混勻，4℃放置 5min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀。再向沉淀中加入 1mL 經預冷 提取液渦旋混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 10min；留上清，棄沉淀。上清液置冰上待測。 ② 液體樣本：直接測定。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、 上機檢測： ① 分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 480nm，蒸餾水調零。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 試劑一 80 蒸餾水 80 樣本 40 40 37℃水浴 20min本試劑盒僅供科研使用 2 試劑二 20 20 試劑二需直接加到反應液里面，且務必混勻（可用槍頭吸 打），95℃水浴中煮沸 10min（可用封口膜纏緊，防止水分 散失），冷卻至室溫。 試劑三 400 400 試劑四 120 120 混勻，95℃水浴 20min，冷卻后，取全部液體至 1 mL 玻 璃比色皿（光徑 1cm）中，480nm 下測定。ΔA=A 測定管 -A 對照管（每個測定管需設一個對照管）。 【注】：若ΔA 值過小如在零附近徘徊，可延長 37℃水浴時間 T（如 40min 或更長），或增加樣本取 樣量 W（如增至 0.2g），或增加樣本的加樣體積 V1（如 60μL，則試劑三相應減少），相應的 變量重新代入計算公式計算。 五、結果計算： 1、標準曲線：y = 0.0042x - 0.0016；x 為蔗糖標準品質量（μg），y 為ΔA。 2、按照蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產生 1μg 蔗糖定義為一個酶活力單位。 SS-Ⅱ活性(μg /min/mg prot)=[(ΔA+0.0016) ÷0.0042]÷(V1×Cpr) ÷T =297.6×(ΔA+0.0016)÷Cpr×D 3、按照樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織每分鐘催化產生 1μg 蔗糖定義為一個酶活力單位。 SS-Ⅱ活性(μg/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0016) ÷0.0042]÷(W×V1÷V) ÷T =297.6×(ΔA+0.0016)÷W 4、按照液體體積計算： 單位定義：每毫升液體每分鐘催化產生 1μg 蔗糖定義為一個酶活力單位。 SS-Ⅱ活性(μg/min/mL)=[(ΔA+0.0016) ÷0.0042]÷V1÷T=297.6×(ΔA+0.0016) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.04mL； T---反應時間，20 min； W---樣本質量，g； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒； 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（10mg/mL）：向標準品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 1.6, 3.2, 4.8, 6.4, 8. mg/mL。也可根據實際 樣本來調整標準品濃度。 3 按照：40μL 標準品+80μL 蒸餾水+20μL 試劑二+400μL 試劑三+120μL 試劑四，依次 加樣操作，95℃水浴 20min，冷卻后，取全部液體至 1 mL 玻璃比色皿（光徑 1cm） 中，480nm 下測定，根據結果即可制作標準曲線。