乙酰fu酶A羧化酶(ACC)試劑盒(定磷法)微板法

乙酰fu酶A羧化酶(ACC)試劑盒(定磷法)微板法

乙酰fu酶A羧化酶(ACC)試劑盒(定磷法)微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 乙酰*酶 A 羧化酶(Acetyl CoA carboxylase，ACC)試劑盒說明書 （貨號：WS3190W 微板法 48 樣） 一、產品簡介： 乙酰*酶A羧化酶（ACC，EC 6.4.1.2）廣泛存在于生物界。在生物體內催化乙酰*酶A 羧化生成丙二酰*酶A，是脂肪酸和許多次生代謝產物合成的關鍵酶。ACC的活性在一定 程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。 ACC 催化乙酰*酶 A、NaHCO3和 ATP 生成丙二酰輔酶 A、ADP 和無機磷，通過鉬酸 銨定磷法測定無機磷的增加量來測定 ACC 酶活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 【注】：全程操作需無磷環境；試劑配置用新槍頭和玻璃移液器等，也可用一次性塑料器皿，避免磷污染。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、乙酰輔酶 A 羧化酶（ACC）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。12000rpm 4℃離心 15min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 細胞樣本： 先收集細胞到離心管內，離心后棄上清；取 500 萬細胞加入 1mL 提取液；超聲波破 碎細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；4oC 約 12,000rpm 離心 10min，取上清作為待測樣品。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，設置溫度 37℃，調節波長至 700nm。 ② 試劑放在 37℃水浴 5min； ③ 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 提取液 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 20mL ×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉體 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 0.55mL 蒸餾水，混勻溶解備用。 試劑三 液體 4mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 A:粉體 mg×1 瓶 B:液體 2mL×1 瓶 4℃保存 臨用前加1.8mL的B液，再加23.2mL 的蒸餾水，混勻溶解備用。 標準品 粉體 mg ×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 試劑一 190 200 樣本 100 100本試劑盒僅供科研使用 2 ④ 顯色反應，在 96 孔板中依次加入： 【注】若△A 差值小于 0.01，可增加樣本取樣質量 W（如增至 0.2g），或增加③步中樣本加樣體 積 V1(如由 100μL 增至 200μL，則試劑一相應減少)，或延長③步中 37℃條件下孵育時間 T （如由 30min 延至 60min），則改變后的 W 和 V1 和 T 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y = 0.6402x - 0.0034，x 是標準品摩爾質量（μmol/mL）, y 是△A。 2、按蛋白濃度計算： 定義：每小時每毫克組織蛋白分解 ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(△A+0.0034)÷0.6404×V2] ÷(V1×Cpr)÷T =10.62×(△A+0.0034)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 定義：每小時每克組織分解 ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h/g 鮮重)=[(△A+0.0034)÷0.6404×V2]÷(W× V1÷V)÷T =10.62×(△A+0.0034)÷W 4、按細菌或細胞密度計算： 定義：每小時每 1 萬個細菌或細胞分解 ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h /104 cell)=[(△A+0.0034)÷0.6404×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.021×(△A+0.0034) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.1mL； V2---酶促反應總體積，0.34mL； T---反應時間，1/2 小時； W---樣本鮮重，g； 500---細菌或細胞總數，500 萬； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（50μmol/mL）：標準品用 1mL 試劑一溶解。（母液需在兩天內用）。 2 把母液用蒸餾水稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根據實際樣 本來調整標準品濃度。 3 依據顯色反應階段測定管的加樣體系操作，根據結果即可制作標準曲線。 試劑二 10 37℃ 孵育 30min 試劑三 40 40 混勻，12000rpm，4℃離心 5min，上清液待測。 上清液 50 50 試劑四 200 200 混勻，室溫靜置 3min，700nm 下讀取各管吸光值， △A=A 測定-A 對照（每個樣本做一個自身對照）。