乙酰fu酶A羧化酶(ACC)試劑盒(定磷法)

乙酰fu酶A羧化酶(ACC)試劑盒(定磷法)

乙酰fu酶A羧化酶(ACC)試劑盒(定磷法)

本試劑盒僅供科研使用 1 乙酰*酶 A 羧化酶(Acetyl CoA carboxylase，ACC)試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS3190F 分光法 24 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 乙酰*酶A羧化酶（ACC，EC 6.4.1.2）廣泛存在于生物界。在生物體內(nèi)催化乙酰*酶A 羧化生成丙二酰*酶A，是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶。ACC的活性在一定 程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。 ACC 催化乙酰*酶 A、NaHCO3和 ATP 生成丙二酰輔酶 A、ADP 和無機(jī)磷，通過鉬酸 銨定磷法測(cè)定無機(jī)磷的增加量來測(cè)定 ACC 酶活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 【注】：全程操作需無磷環(huán)境；試劑配置用新槍頭和玻璃移液器等，也可用一次性塑料器皿，避免磷污染。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、 冰和蒸餾水。 四、乙酰輔酶 A 羧化酶（ACC）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。12000rpm 4℃離心 15min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液；超聲波破 碎細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；4oC 約 12,000rpm 離心 10min，取上清作為待測(cè)樣品。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 可見分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，設(shè)置溫度 37℃，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 700nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 試劑放在 37℃水浴 5min； ③ 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 提取液 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 20mL ×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉體 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 0.55mL 蒸餾水，混勻溶解備用。 試劑三 液體 4mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 A:粉體 mg×1 瓶 B:液體 3mL×1 瓶 4℃保存 臨用前加2.9mL的B液，再加37.1mL 的蒸餾水，混勻溶解備用。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管本試劑盒僅供科研使用 2 ④ 顯色反應(yīng)，在 EP 管中依次加入： 【注】若△A 差值小于 0.01，可增加樣本取樣質(zhì)量 W（如增至 0.2g），或增加③步中樣本加樣體積 V1(如由 150μL 增至 300μL，則試劑一相應(yīng)減少),或延長(zhǎng)③步中 37℃條件下孵育時(shí)間 T（如由 30min 延至 60min），則改變后的 W 和 V1 和 T 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.8474x - 0.0164，x 是標(biāo)準(zhǔn)品摩爾質(zhì)量（μmol/mL），y 是△A。 2、按蛋白濃度計(jì)算： 定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mg prot)= [(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷(V1×Cpr)÷T=8.03×(△A+0.0164)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 定義：每小時(shí)每克組織分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/g 鮮重)=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷(W×V1÷V)÷T =8.03×(△A+0.0164)÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 定義：每小時(shí)每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/104 cell)=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2] ÷(500×V1÷V)÷T=0.016×(△A+0.0164) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.15mL； V2---酶促反應(yīng)總體積，0.51mL； T---反應(yīng)時(shí)間，1/2 小時(shí)； W---樣本鮮重，g； 500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（50μmol/mL）：標(biāo)準(zhǔn)品用 1mL 試劑一溶解。（母液需在兩天內(nèi)用）。 2 把母液用蒸餾水稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣 本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)顯色反應(yīng)階段測(cè)定管的加樣體系操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 試劑一 280 300 樣本 150 150 試劑二 20 37℃ 孵育 30min 試劑三 60 60 混勻，12000rpm，4℃離心 5min，上清液待測(cè) 上清液 150 150 試劑四 600 600 混勻，室溫靜置 3min，全部澄清液體轉(zhuǎn)移至 1mL 玻 璃比色皿中，700nm 下讀取各管吸光值，△A=A 測(cè) 定-A 對(duì)照（每個(gè)樣本做一個(gè)自身對(duì)照）。