多功能氧化酶（MFO）試劑盒,微板法

多功能氧化酶（MFO）試劑盒,微板法

多功能氧化酶（MFO）試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 多功能氧化酶 (MFO)活性測定說明書 （貨號：WS5190W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 多功能氧化酶 (MFO)是生物體內重要的一種解毒酶，可使昆蟲適應植物的變化；減弱或 免受植物誘導抗性產生的有毒次生物質對昆蟲的毒害。 多功能氧化酶（MFO）催化對硝基苯甲醚產生對硝基*酚，該產物在 405nm 下有特征吸 收峰，通過檢測該物質在 405nm 處的光吸收增加速率，進而得出 MFO 活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、多功能氧化酶 (MFO)活性檢測： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。 4℃×12000rpm 離心 10min， 取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取。 ② 細菌/細胞樣本： 先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測；若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 405nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 提取液 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×2 支 4℃保存 每支用前甩幾下使試劑落入底部，分 別加入 0.6mL 乙醇，*全溶解后備 用，現配現用。 試劑二 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 粉體 mg×2 支 -20℃保存 臨用前甩幾下或離心使試劑落到底 部，每支加 1.2mL 蒸餾水溶解，用不 完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反 復凍融，三天內用完。 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑。 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 50 試劑一 10本試劑盒僅供科研使用 2 【注】：若ΔA 小于 0.005，可增加樣本量 V1（如增至 80μL，則試劑二相應減少），或增加取樣質量 W（如增至 0.2g），則改變后的樣本量 V1 和樣本質量 W 需代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y =1.7082x-0.0005， PNP 摩爾濃度（μmoL/mL），y 是△A。 2、按樣本鮮重計算： 酶活定義：每克組織每分鐘產生 1nmoL 的對硝基*酚（PNP）為 1 個酶活單位。 MFO(nmoL/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0005)÷1.7082×103×V1]÷(W×V1÷V)÷T =19.5×(ΔA+0.0005)÷W 3、按樣本蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘產生 1nmoL 的對硝基*酚（PNP）為一個酶活單位。 MFO(nmoL/min/mg prot)=[(ΔA+0.0005)÷1.7082×103×V1]÷(V1×Cpr)÷T =19.5×(ΔA+0.0005)÷Cpr 4、按細胞數量計算： 酶活定義：每 104個細胞每分鐘產生 1nmoL 的對硝基*酚（PNP）為一個酶活單位。 MFO(nmoL/min/104cell)=[(ΔA+0.0005)÷1.7082×103×V1]÷(500×V1÷V)÷T =0.039×(ΔA+0.0005) 5、按液體體積計算： 酶活定義：每毫升液體每分鐘產生 1nmoL 的對硝基*酚（PNP）為一個酶活單位。 MFO(nmoL/min/mL)=[(ΔA+0.0005)÷1.7082×103×V1]÷V1÷T=19.5×(ΔA+0.0005) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.05mL； T---反應時間，30 min； W---樣本質量，g； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的蛋白含量測定試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（10μmoL/mL）：向標準品 EP 管里面加入 1.4mL 蒸餾水超聲溶解。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標準品：0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 μmoL/ml。也可 根據實際樣本來調整標準品濃度。 3 依據加樣表操作，根據結果即可制作標準曲線。 試劑二 60 試劑三 20 混勻，立即于 405nm 處讀取吸光值 A1， 37℃孵育 30min 后讀取 A2，ΔA=A2-A1。