胞漿-3-磷酸甘油脫氫酶（ctGPD）活性試劑盒

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胞漿-3-磷酸甘油脫氫酶（ctGPD）活性試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 胞漿-3-磷酸甘油脫氫酶（ctGPD）活性測定試劑盒說明書 （貨號：WS6190F 分光法 48 樣） 一、產品簡介： 胞漿-3-磷酸甘油脫氫酶（ctGPD，EC 1.1.1.8）的酶活水平直接決定了葡萄糖分解代謝 過程中向甘油合成方向的物質流分配量，也因此決定甘油的生成水平。 ctGPD 為 NAD 依賴型，催化磷酸二羥丙酮生成 3-磷酸甘油。通過 340nm 下測定 NADH 的下降量，進而得出 ctGPD 的酶活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 50mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×3 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底 部，每支分別加 0.44mL 蒸餾水溶 解備用。用不完的試劑分裝后-20℃ 保存，禁止反復凍融，三天內用完。 試劑二 液體 37mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底 部，加 1.1mL 蒸餾水充分溶解。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 石英比色皿（光徑 1cm）、可調試移液器、臺式離心機、水浴 鍋、研缽、冰和蒸餾水。 四、胞漿-3-磷酸甘油脫氫酶（ctGPD）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g）到研缽內，加入 1mL 提取液，在冰上進 行冰浴勻漿或者液氮研磨。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：也可以按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取。 ② 細菌/真菌樣本： 先收集細菌/真菌到離心管內，離心后棄上清；取 500 萬細菌/真菌加入 1mL 提取液； 冰浴超聲波破碎細菌/真菌（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：也可按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取） ③ 液體樣本：澄清的液體樣本直接檢測，若渾濁則離心后取上清液檢測。 2、上機檢測： ① 可見分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。 ② 在 EP 管中依次加入下列試劑： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 80 試劑一 20 試劑二 640 試劑三 20本試劑盒僅供科研使用 2 混勻后立即在 340nm 處讀取 A1 值，5min 后讀取 A2。ΔA=A1-A2。 【注】：加完試劑三即啟動反應，所以試劑三加完需立即檢測，若 A1 超過 1.5 或ΔA 超過 0.4，則 減少樣本上樣量，試劑二相應增加保持原體系不變（如樣本上樣量減為 40μL 時，試劑二 增為 680μL），或減少反應時間 T（如減為 2min）。則改變后的 V1 和反應時間 T 需帶入 計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、按樣本鮮重計算： 酶活定義：每克組織每分鐘內氧化 1 nmol NADH 定義為一個酶活單位。 ctGPD（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(W× V1÷V)÷T=305.5×ΔA÷W 2、按樣本蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘內氧化 1 nmol NADH 定義為一個酶活單位。 ctGPD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(V1×Cpr)÷T =305.5×ΔA÷Cpr 3、按細胞數量計算： 酶活定義：每 104個細胞每分鐘內氧化 1 nmol NADH 定義為一個酶活單位。 ctGPD（nmol/min/104cell）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.611×ΔA 4、按液體體積計算： 酶活定義：每毫升液體每分鐘內氧化 1 nmol NADH 定義為一個酶活單位。 ctGPD（nmol/min/mL）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷V1÷T=305.5×ΔA V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.08mL； V2---反應體系總體積，7.6×10-4 L； d---光徑，1cm； ε---NADH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm； W---樣本質量，g； T---反應時間，5min； Cpr---蛋白濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測定試劑盒。