胞漿-3-磷酸甘油脫氫酶活性試劑盒微板法

胞漿-3-磷酸甘油脫氫酶活性試劑盒微板法

胞漿-3-磷酸甘油脫氫酶活性試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 胞漿-3-磷酸甘油脫氫酶（ctGPD）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS6190W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 胞漿-3-磷酸甘油脫氫酶（ctGPD，EC 1.1.1.8）的酶活水平直接決定了葡萄糖分解代謝 過(guò)程中向甘油合成方向的物質(zhì)流分配量，也因此決定甘油的生成水平。 ctGPD 為 NAD 依賴型，催化磷酸二羥丙酮生成 3-磷酸甘油。通過(guò) 340nm 下測(cè)定 NADH 的下降量，進(jìn)而得出 ctGPD 的酶活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×3 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底 部，每支分別加 0.44mL 蒸餾水溶 解備用。用不完的試劑-20℃保存， 禁止反復(fù)凍融，三天內(nèi)用完。 試劑二 液體 17mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底 部，加 1.1mL 蒸餾水充分溶解。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、可調(diào)試移液器、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、研缽、冰和蒸餾水。 四、胞漿-3-磷酸甘油脫氫酶（ctGPD）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g）到研缽內(nèi)，加入 1mL 提取液，在冰上進(jìn) 行冰浴勻漿或者液氮研磨。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 [注]：也可以按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取） ② 細(xì)菌/真菌樣本： 先收集細(xì)菌/真菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬(wàn)細(xì)菌/真菌加入 1mL 提取液； 冰浴超聲波破碎細(xì)菌/真菌（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 [注]：也可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取） ③ 液體樣本：澄清的液體樣本直接檢測(cè)，若渾濁則離心后取上清液檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm。 ② 在 96 孔板中依次加入下列試劑： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 20 試劑一 10 試劑二 160 試劑三 10 混勻后立即在 340nm 處讀取 A1 值，5min 后讀取 A2。本試劑盒僅供科研使用 2 ΔA=A1-A2。 【注】：加完試劑三即啟動(dòng)反應(yīng)，所以試劑三加完需立即檢測(cè)，若 A1 超過(guò) 1.2 或ΔA 超過(guò) 0.35，則 減少樣本上樣量，試劑二相應(yīng)增加保持原體系不變（如樣本上樣量減為 10μL 時(shí)，試劑二 增為 170μL），或減少反應(yīng)時(shí)間 T（如減為 2min）。則改變后的 V1 和反應(yīng)時(shí)間 T 需帶入 計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按樣本鮮重計(jì)算： 酶活定義：每克組織每分鐘內(nèi)氧化 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活單位。 ctGPD（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(W× V1÷V)÷T=643.1×ΔA÷W 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘內(nèi)氧化 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活單位。 ctGPD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(V1×Cpr)÷T =643.1×ΔA÷Cpr 3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 酶活定義：每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘內(nèi)氧化 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活單位。 ctGPD（nmol/min/104cell）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(500×V1÷V)÷T=1.29×ΔA 4、按液體體積計(jì)算： 酶活定義：每毫升液體每分鐘內(nèi)氧化 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活單位。 ctGPD（nmol/min/mL）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷V1÷T=643.1×ΔA V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.02mL； V2---反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L； d---光徑，0.5cm； ε---NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm； W---樣本質(zhì)量，g； T---反應(yīng)時(shí)間，5min； Cpr---蛋白濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測(cè)定試劑盒。