線粒體-3-磷酸甘油脫氫酶活性試劑盒

線粒體-3-磷酸甘油脫氫酶活性試劑盒

線粒體-3-磷酸甘油脫氫酶活性試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 線粒體-3-磷酸甘油脫氫酶（mt-GPD）活性測定試劑盒說明書 （貨號：WS7190F 分光法 48 樣） 一、產品簡介： 線粒體-3-磷酸甘油脫氫酶（mt-GPD）存在于線粒體中，在 3-磷酸甘油途徑中起重要 作用，催化底物 3-磷酸甘油生成磷酸二羥丙酮，同時生成的電子和氫進入呼吸鏈參與氧 化磷酸化；在電子傳遞體（PMS）存在下，使噻唑藍（MTT）還原生成藍色產物，通過 檢測該藍色產物在 550nm 處的增加速率，即可得出 mt-GPD 活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 試劑一 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體 0.5mL×1 支 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×2 支 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底 部，每支加 1.2mL 的蒸餾 水溶解。一周內用完。 試劑二 粉劑 mg×4 支 -20℃保存 用前甩幾下使試劑落入底 部，每支加 0.6mL 的蒸餾 水溶解。一天內用完。 試劑三 液體 35mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底 部，臨用前加 4.4mL 蒸餾 水溶解。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、石英比色皿(光徑 1cm)、可調試移液器、臺式離心機、水浴鍋、研缽、 冰和蒸餾水。 四、線粒體-3-磷酸甘油脫氫酶（mtGPD）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、線粒體制備（提示：整個線粒體的提取過程須保持 4℃低溫環境）： ① 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細菌/細胞，加入 1mL 試劑一，用冰浴勻漿器或研缽勻 漿，轉移至離心管后于 4℃×700g 離心 10min。 ② 棄沉淀，上清液移至另一離心管中，4℃×12000g 離心 10min。用移液器移除上清液(上 清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的酶活性（此步可選做）)，留下沉淀 （沉淀即為線粒體）。 ③ 在沉淀（線粒體）中加入200μL試劑二和2μL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或 200W，超聲3s，間隔10秒，重復30次），液體置于冰上用于線粒體-3-磷酸甘油脫氫酶 （mtGPD）活性測定。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取，或按照 細菌/細胞數量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 2、上機檢測： ① 可見分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 550nm，蒸餾水調零。 ② 在 EP 管中依次加入下列試劑：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 80 試劑一 40 試劑二 40 試劑三 600 試劑四 40 混勻后立即在 550nm 處讀取 A1 值，5min 后讀取 A2。 ΔA=A2-A1。 【注】：加完試劑四即啟動反應，所以試劑四加完需立即檢測，若ΔA 小于 0.05，則 增加樣本上樣量 V1，試劑三相應減少保持原體系不變（如樣本上樣量為 160μL 時，試劑三為 520μL）。則改變后的 V1 需帶入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、 按樣本蛋白濃度計算 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘還原 1 nmol 噻唑藍（MTT）定義為一個酶活性單位。 mtGPD 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(V1×Cpr) ÷T=247×ΔA÷Cpr 2、 按樣本鮮重計算 酶活定義：每克組織每分鐘還原 1 nmol 噻唑藍（MTT）定義為一個酶活性單位。 mtGPD 活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(W×V1÷V)÷T=49.9×ΔA÷W 3、 按細菌或細胞密度計算 酶活定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘還原 1 nmol 噻唑藍（MTT）定義為一個酶活單位。 mtGPD 活性（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.1×ΔA ε---還原型 MTT 的摩爾消光系數，8.1×103 L/mol/cm； d---比色皿光徑，1cm； V---加入提取液體積，0.202mL； V1---加入樣本體積，0.08mL； V2---反應體系總體積，8×10-4 L； T---反應時間，5min； W---樣本質量，g； 500---細菌或細胞總數，500 萬； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。