3-磷酸甘油酯酶（GPP）活性試劑盒,微板法

3-磷酸甘油酯酶（GPP）活性試劑盒,微板法

3-磷酸甘油酯酶（GPP）活性試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 3-磷酸甘油酯酶（GPP）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS8190W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 3-磷酸甘油酯酶（GPP，EC3.1.3.21）催化 3-磷酸甘油脫下磷酸根離子形成甘油，是甘 油合成過(guò)程中的最后一步酶促反應(yīng)，該酶活性的高低直接決定甘油的生成水平。 本試劑盒采用 3-磷酸甘油為底物，用鉬酸銨顯色劑測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)酶催化產(chǎn)生的磷酸 根離子的量，進(jìn)而得出 3-磷酸甘油酯酶的活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱(chēng) 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 瓶 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底 部，臨用前加 6mL 蒸餾水溶解備 用。用不完的試劑 4℃保存。 試劑二 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 A:粉體 mg×1 瓶 B:液體 2mL×1 瓶 4℃保存 臨用前在試劑 A 中加 1.8mL 的 B 液，再加 23.2mL 的蒸餾水，混 勻溶解備用。用不完的試劑 4℃ 保存，若試劑變色則舍棄。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 【注】：全程操作需無(wú)磷環(huán)境；試劑配置用新的槍頭和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿， 免磷污染。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、EP 管、96 孔板、可調(diào)試移液器、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、研缽、冰和蒸餾水。 四、α-磷酸甘油酯酶（GPP）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g）到研缽內(nèi)，加入 1mL 提取液，在冰上進(jìn) 行冰浴勻漿或者液氮研磨。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 [注]：也可以按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取。 ② 細(xì)菌/真菌樣本： 先收集細(xì)菌/真菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬(wàn)細(xì)菌/真菌加入 1mL 提取液； 冰浴超聲波破碎細(xì)菌/真菌（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 [注]：也可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：澄清的液體樣本直接檢測(cè)，若渾濁則離心后取上清液檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 700nm。 ② 在 EP 管中依次加入下列試劑：本試劑盒僅供科研使用 2 ③ 顯色反應(yīng)，在 96 孔板中加入： 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.5117x + 0.0026，x 是標(biāo)準(zhǔn)品摩爾質(zhì)量（μmol/mL）, y 是△A。 2、按蛋白濃度計(jì)算： 定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白分解底物產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 GPP(μmol/h/mg prot)= [(△A-0.0026)÷0.5117×V2] ÷（V1×Cpr）÷T=15.63×(△A-0.0026)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 定義：每小時(shí)每克組織分解底物產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 GPP(μmol/h/g 鮮重)= [(△A-0.0026)÷0.5117×V2]÷(W× V1÷V)÷T=15.63×(△A-0.0026)÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 定義：每小時(shí)每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞分解底物產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 GPP(μmol/h /104 cell)= [(△A-0.0026)÷0.5117×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.031×(△A-0.0026) 5、按液體體積計(jì)算: 定義：每小時(shí)每毫升液體分解底物產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 GPP(μmol/h/mL)=[( △A-0.0026)÷0.5117×V2]÷V1÷T=15.63×(△A-0.0026) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.05mL ； V2---酶促反應(yīng)總體積，0.2mL； T---反應(yīng)時(shí)間，1/2 小時(shí)； W---樣本鮮重，g； 500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。 Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程： 1. 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（5μmol/mL）：標(biāo)準(zhǔn)品用 10mL 試劑一溶解。（母液需在兩天內(nèi)用）。 2. 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來(lái)調(diào)整標(biāo) 準(zhǔn)品濃度。 3. 依據(jù)顯色反應(yīng)階段測(cè)定管的加樣體系操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 試劑名稱(chēng)（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 50 提取液 50 50 試劑一 50 50 混勻，37℃孵育 30min。 試劑二 50 50 樣本 50 混勻，12000rpm，4℃離心 5min，取上清待測(cè)。 上清液 50 50 試劑三 200 200 混勻，室溫靜置 3min，700nm 下讀取各管吸光值 A， △A=A 測(cè)定-A 對(duì)照（每個(gè)樣本做一個(gè)自身對(duì)照）。