3-磷酸甘油酯酶（GPP）活性試劑盒

3-磷酸甘油酯酶（GPP）活性試劑盒

3-磷酸甘油酯酶（GPP）活性試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 3-磷酸甘油酯酶（GPP）活性測定試劑盒說明書 （貨號：WS8190F 分光法 24 樣） 一、產品簡介： 3-磷酸甘油酯酶（GPP，EC3.1.3.21）催化 3-磷酸甘油脫下磷酸根離子形成甘油，是甘 油合成過程中的最后一步酶促反應，該酶活性的高低直接決定甘油的生成水平。 本試劑盒采用 3-磷酸甘油為底物，用鉬酸銨顯色劑測定單位時間內酶催化產生的磷酸 根離子的量，進而得出 3-磷酸甘油酯酶的活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 35mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 瓶 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底 部，臨用前加 3.6mL 蒸餾水溶解 備用。用不完的試劑 4℃保存。 試劑二 液體 3mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 A:粉體 mg×1 瓶 B:液體 3mL×1 瓶 4℃保存 臨用前在試劑 A 中加 2.7mL 的 B 液，再加 34.8mL 的蒸餾水，混 勻溶解備用。用不完的試劑 4℃ 保存，若試劑變色則舍棄。 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 【注】：全程操作需無磷環境；試劑配置用新的槍頭和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿， 免磷污染。 三、所需的儀器和用品： 分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、可調試移液器、臺式離心機、水浴鍋、 研缽、冰。 四、α-磷酸甘油酯酶（GPP）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g）到研缽內，加入 1mL 提取液，在冰上進 行冰浴勻漿或者液氮研磨。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 [注]：也可以按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取。 ② 細菌/真菌樣本： 先收集細菌/真菌到離心管內，離心后棄上清；取 500 萬細菌/真菌加入 1mL 提取液； 冰浴超聲波破碎細菌/真菌（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 12000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 [注]：也可按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取） ③ 液體樣本：澄清的液體樣本直接檢測，若渾濁則離心后取上清液檢測。 2、上機檢測： ① 可見分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 700nm，蒸餾水調零。 ② 在 EP 管中依次加入下列試劑：本試劑盒僅供科研使用 2 ③ 顯色反應，在 EP 管中加入： 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y = 0.6624x - 0.003，x 是標準品摩爾質量（μmol/mL）, y 是△A。 2、按蛋白濃度計算： 定義：每小時每毫克組織蛋白分解底物產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 GPP(μmol/h/mg prot)= [(△A+0.003)÷0.6624×V2] ÷（V1×Cpr）÷T=12.08×(△A+0.003)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 定義：每小時每克組織分解底物產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 GPP(μmol/h/g 鮮重)= [(△A+0.003)÷0.6624×V2]÷(W× V1÷V)÷T=12.08×(△A+0.003)÷W 4、按細菌或細胞密度計算： 定義：每小時每 1 萬個細菌或細胞分解底物產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 GPP(μmol/h /104 cell)= [(△A+0.003)÷0.6624×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.024×(△A+0.003) 5、按液體體積計算: 定義：每小時每毫升液體分解底物產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 GPP(μmol/h/mL)=[(△A+0.003)÷0.6624×V2]÷V1÷T=12.08×(△A+0.003) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.06mL ； V2---酶促反應總體積，0.24mL； T---反應時間，1/2 小時； W---樣本鮮重，g； 500---細菌或細胞總數，500 萬。 Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1. 制備標準品母液（5μmol/mL）：標準品用 10mL 試劑一溶解。（母液需在兩天內用）。 2. 把母液稀釋成六個濃度：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根據實際樣本來調整標準品濃度。 3. 依據顯色反應階段測定管的加樣體系操作，根據結果即可制作標準曲線。 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 60 提取液 60 60 試劑一 60 60 混勻，37℃孵育 30min。 試劑二 60 60 樣本 60 混勻，12000rpm，4℃離心 5min，取上清待測。 上清液 150 150 試劑三 600 600 混勻，室溫靜置 3min，全部液體轉移至 1mL 玻璃比色皿 （光徑 1cm），700nm 下讀取各管吸光值 A， △A=A 測定-A 對照（每個樣本做一個自身對照）。