肉桂醇脫氫酶(CAD)試劑盒,微板法

肉桂醇脫氫酶(CAD)試劑盒,微板法

肉桂醇脫氫酶(CAD)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 肉桂醇脫氫酶（ Cinnamyl-alcohol dehydrogenase，CAD)試劑盒說明書 （WS2001W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 肉桂醇脫氫酶(CAD，EC 1.1.1.195）是作為植物次生代謝特別是木質素合成的關鍵酶, 與植物生長發育和抵御病原菌入侵關系密切。本試劑盒提供一種簡單，靈敏，快速的測定方 法：CAD 催化肉桂醇和 NADP+生成肉桂醛和 NADPH，進而與特異的顯色劑反應產生有色 物質，通過檢測有有色物質的增加速率，進而計算出 CAD 酶活性的大小。 二、試劑盒組分與配制： 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、肉桂醇脫氫酶（CAD）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備 ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。 12000rpm 4℃離心 15min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、 上機檢測 ① 酶標儀預熱 30min 以上，溫度設定 37℃，調節波長至 450nm。 ② 試劑放在 37℃水浴 5min； ③ 按照下表在 96 孔板中依次加入試劑： 【注】：若ΔA 在零附近徘徊，可延長反應時間 T（如：40min 或更長）， 或加大樣本量 V1（如增至 50μL，則試劑三相應減少），重新 調整后的反應時間 T 和 V1 需代入計算公式重新計算。 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 5mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體×1 支 4℃保存 試劑三 粉劑 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前加入 14mL 提取液充分溶解，制備 成反應 mix；用不完的試劑 4℃保存; 標準品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 20 試劑一 40 試劑二 10 試劑三 130 混勻，立即 450nm 下讀取 A1 值，避光孵育 30min 后讀取 A2 值。ΔA=A2-A1。本試劑盒僅供科研使用 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y=1.5919x-0.0046，x 是 NADPH 摩爾濃度：μmol/mL，y 是ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計算： 單位的定義：在 37℃，每毫克組織蛋白每分鐘使 1 nmol 肉桂醇氧化成 1 nmol 肉桂醛并且 使 1 nmol NADP+轉換成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。 CAD（nmol/min/mg prot）＝[(ΔA+0.0046)÷1.5919×V1×103]÷(V1×Cpr) ÷T =20.94×(ΔA+0.0046)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 單位的定義：在 37℃，每毫克組織蛋白每分鐘使 1 nmol 肉桂醇氧化成 1 nmol 肉桂醛并且 使 1 nmol NADP+轉換成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。 CAD（nmol/min/g 鮮重）＝[(ΔA+0.0046)÷1.5919×V1×103]÷(W ×V1÷V) ÷T =20.94×(ΔA+0.0046)÷W 4、液體樣本中 CAD 活力計算: 單位的定義：在 37℃，每毫克組織蛋白每分鐘使 1 nmol 肉桂醇氧化成 1 nmol 肉桂醛并且 使 1 nmol NADP+轉換成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。 CAD（nmol/min /mL）＝[(ΔA+0.0046)÷1.5919×V1×103]÷V1÷T=20.94×(ΔA+0.0046) V：加入提取液體積，1 mL； V1：加入樣本體積，0.02 mL； T：反應時間，30 min； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL； W：樣本質量，g。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（0.5μmol /ml）：向標準品 EP 管里面加入 0.6ml 蒸餾水。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 0.1,0.2,0.3,0.4, 0.5.μmol/ml。也可根據實際 樣本來調整標準品濃度。 3 依據加樣表操作，根據結果即可制作標準曲線。 2