4-香豆酸fu酶A連接酶(4CL)試劑盒

4-香豆酸fu酶A連接酶(4CL)試劑盒

4-香豆酸fu酶A連接酶(4CL)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 11 4-香豆酸：輔酶 A 連接酶（ 4-coumarate:CoA ligase，4CL) 試劑盒說明書 （貨號：WS3001F 分光法 48 樣） 一、產品簡介： 4-香豆酸：*酶 A 連接酶（4CL ，EC 6.2.1.12）是木質素生物合成的關鍵酶之一，位于 苯丙酸途徑與木質素特異合成途徑的轉折點上，主要催化肉桂酸生成相應的肉桂酸*酶 A 酯。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中，研究該酶可以探討多種生物細胞發育過程 中木質素沉積的代謝機理，為減少水果石細胞含量而提高其品質提供依據。 4CL 催化 4-香豆酸和 CoA 生成 4-香豆酸 CoA，在 333nm 下測 4-香豆酸 CoA 生成速率， 即可反映 4CL 活性。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 28mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑×1 瓶 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 5mL 蒸 餾水，于 80-100℃水浴 1-2 分鐘溶解備用。 試劑三 粉劑×1 瓶 -20℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 4.1mL 蒸餾水充分溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 紫外分光光度計、1mL 石英比色皿（光徑 1cm）、低溫臺式離心機、可調式移液器、 研缽、冰和蒸餾水。 四、4-香豆酸：輔酶 A 連接酶（ 4CL)活性測定： 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。 4℃×12000rpm 離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 ② 細菌或培養細胞 先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取 液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 4℃×12000rpm 離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照數量（104）：提取液體積(mL)為 500-1000：1 的比例進行提取 ③ 液體樣本：若是澄清液體，直接檢測，若液體樣本渾濁，需 4℃×12000rpm，離心 10min，取上清液檢測。 2、 上機檢測： 1 紫外分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 333nm，蒸餾水調零。 2 所有試劑至常溫狀態。 3 在 1mL 石英比色皿中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 80 試劑一 560本試劑盒僅供科研使用 22 試劑二 80 試劑三 80 混勻，室溫（25℃）下立即于 333nm 處讀取吸 光值 A1，30min 后再讀取 A2，△A=A2-A1。 【注】1. 若△A 在零附近徘徊，可加大樣本量（如增至 160μL，則試劑一相應減少），或延長 反應時間 T，則改變后的樣本體積 V1 和 T 需代入公式重新計算。 2. 若上升趨勢不穩定，可每隔 2min 讀取一次吸光值，選取一段線性上升時間段來參與 計算，相對應的 A 值也代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、按樣本蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘使吸光值變化 0.005 所需的酶量定義為一個酶活力單位。 4CL(U/mg prot)=ΔA÷(V1×Cpr)÷0.005÷T=83.3×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計算： 酶活定義：每克組織每分鐘使吸光值變化 0.005 所需的酶量定義為一個酶活力單位。 4CL(U/g 鮮重)=ΔA÷(W×V1÷V)÷0.005÷T=83.3×ΔA÷W 3、按細菌或細胞密度計算： 酶活定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘使吸光值變化 0.005 所需的酶量定義為一個酶活單位。 4CL(U/104 cell)=ΔA÷(500×V1÷V)÷0.005÷T=0.17×ΔA 4、按液體體積計算： 酶活定義：每毫升液體每分鐘使吸光值變化 0.005 所需的酶量定義為一個酶活單位。 4CL(U/mL)=ΔA÷V1÷0.005÷T=83.3×ΔA V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.08 mL； T---反應時間，30min； W---樣本質量，g； 500---細菌或細胞總數，500 萬。 Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。