錳過氧化物酶(Mnp)試劑盒

錳過氧化物酶(Mnp)試劑盒

錳過氧化物酶(Mnp)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 錳過氧化物酶（Manganese peroxidase，Mnp）試劑盒說明書 （貨號：WS4001F 分光法 48 樣） 一、產品簡介： 錳過氧化物酶（EC1.11.1.13，Mnp）是真菌分泌的一種糖基化的胞外蛋白，含亞鐵血紅 素的過氧化物酶，主要存在于引起白腐的木腐菌和土壤枯草菌這兩個擔子真菌中，屬于木 質素降解酶系，能有效的降解木質素及廢水和環境中其他一些抗性物質，如腐殖質酸和包 括多環芳烴在內的多種有機污染物等。 錳過氧化物酶（Mnp）在 Mn2+存在的條件下，將二甲氧基*酚（DMP）氧化生成的產物 在 470nm 處有特征吸收峰。通過檢測該產物在 470nm 處的增加速率，即可得到 Mnp 酶活 性大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑×1 瓶 4℃保存 用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 5mL 無水乙醇溶解備用。 試劑三 粉劑×1 瓶 4℃保存 用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 3mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑四 液體×1 支 4℃保存 用前甩幾下使液體落入底部，取出 3µL 液體至新的 EP 管中，再加 1.5mL 蒸餾水混勻備用。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、天平、低溫離心機、研缽、冰和蒸餾水。 四、錳過氧化物酶（ Mnp)活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。 4℃×12000rpm 離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 ② 細菌或培養細胞： 先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取 液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 4℃×12000rpm 離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照數量（104）：提取液體積(mL)為 500-1000：1 的比例進行提取 ③ 液體樣本：若是澄清液體，直接檢測，若液體樣本渾濁，需 4℃×12000rpm，離心 10min，取上清液檢測。 2、上機檢測： 1 可見分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 470nm，蒸餾水調零。 2 所有試劑至常溫狀態（25℃）。 3 在 1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）中依次加入：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱（µL） 測定管 樣本 80 試劑一 580 試劑二 80 試劑三 40 試劑四 20 混勻，30℃條件下反應，10s 時讀取 A1，10min 后讀取 A2，△A=A2-A1。 【注】若△A 在零附近徘徊，可增加樣本量（如增至 40µL，則試劑一相應減少），或延長反應 時間 T 至 15min 或更長，則改變后的樣本 V1 和反應時間 T 需代入公司重新計算。 五、結果計算： 1．按照蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol 的 DMP 所需酶量為一個酶活力單位。 MnP 活性(nmol/min/mg prot)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=18.2×△A÷Cpr 2．按照樣本質量計算： 酶活定義：每克樣品每分鐘氧化 1nmol 的 DMP 所需酶量為一個酶活力單位。 MnP 活性(nmol/min/g 鮮重)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=18.2×△A÷W 3．按照細胞數量計算： 酶活定義：每 104個細胞每分鐘氧化 1nmol 的 DMP 所需酶量為一個酶活力單位。 MnP 活性(nmol/min/104 cell)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(細胞數量×V1÷V)÷T =18.2×ΔA÷細胞數量 4．按照液體體積計算： 酶活定義：每毫升液體每分鐘氧化 1nmol 的 DMP 所需酶量為一個酶活力單位。 MnP 活性(nmol/min/mL)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=18.2×ΔA ε---DMP 被氧化的產物的摩爾消光系數：55000L/mol/cm； d---光徑，1cm； V---加入提取液體積，1mL； V1---反應中樣本體積，0.08mL； V2---反應總體積，8×10-4 L； W---樣本質量，g； T---反應時間，10min； Cpr---樣本蛋白濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。