谷an酸脫羧酶(GAD)試劑盒,微板法

谷an酸脫羧酶(GAD)試劑盒,微板法

谷an酸脫羧酶(GAD)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 谷*酸脫羧酶（GAD）測定試劑盒說明書 （貨號：WS2011W 微板法 48 樣） 一、產品簡介： 谷*酸脫羧酶 (GAD，EC 4.1.1.15)是一種吡哆醛類裂解酶，能專一的催化 L-谷*酸 裂解成為 γ-氨基丁酸 (GABA)和 CO2。GAD 廣泛分布于動植物和微生物中：哺乳動物 體內 GAD 催化產生的 GABA 是一種重要的抑制性神經遞質；在植物中 GAD 的活性高 低可指示種子發芽能力和出苗率等。 本試劑盒利用*酚和次氯酸鈉比色法測定谷an酸脫羧酶（GAD）催化產生的 GABA， 最終生成藍色物質，該物質在 645nm 處有明顯光吸收，其顏色深淺與 GABA 含量呈正 比，進而得出 GAD 活力大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 11mL 試劑二溶解備用， 試劑二 液體 22mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 1mL×1 支 4℃保存 試劑五 液體 8mL×1 瓶 4℃保存 試劑六 A：液體 4mL×2 瓶 B：液體 5mL×1 瓶 4℃保存 臨用前取 2mL 的 B 液進一瓶 A 液 中，混勻后作為試劑六使用。混勻 后的試劑半個月內用完。 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該標曲。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、水浴鍋、離心機、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、谷an酸脫羧酶（GAD）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、 樣本制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min， 取上清液待用。 ② 細菌/細胞樣本：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細 胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s， 重復 30 次）；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 ③ 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、 上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 645nm，在 EP 管依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 100 100 試劑一 200 試劑二 200 混勻，40℃孵育 30min 試劑三 200 200本試劑盒僅供科研使用 2 混勻，室溫 12000rpm，離心 3min，上清液待測。 ② 顯色反應：在 96 孔板中依次加入： 上清液 80 80 試劑三 50 50 試劑四 10 10 試劑五 80 80 試劑六 80 80 混勻，20℃放置 20min，于 645nm 處讀取各管的 A 值， △A=A 對照-A 測定(每個樣本需做一個自身對照)。 【注】若ΔA 值在零附近，可增加樣本質量 W（如增至 0.2g），或延長 40℃孵育時間 T（如增 至 1h 或更長），或加大樣本量 V1（如增至 100μL，則試劑一和二相應減少），或增加② 步中上清液體積（由 80μL 增至 130μL 則試劑三相應減少），則改變后的 W 和 T 和 V1 和 V3 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線：y = 4.3244x - 0.0017，x 為標準品摩爾質量(μmol)，y 為吸光值ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘產生 1nmol 的 GABA 定義為一個酶活力單位。 GAD(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0017)÷4.3244]×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T×103 =481.8×(ΔA+0.0017)÷Cpr 3、 按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織每分鐘產生 1nmol 的 GABA 定義為一個酶活力單位。 GAD(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0017)÷4.3244]×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T×103 =481.8×(ΔA+0.0017)÷W 4、按細胞數量計算： 單位定義：每 104個細胞每分鐘產生 1nmol 的 GABA 定義為一個酶活單位。 GAD(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0017)÷4.3244]×(V2÷V3)÷(500×V1÷V)÷T×103 =0.964×(△A+0.0017) 5、按照液體體積計算： 單位定義：每毫升液體每分鐘產生 1nmol 的 GABA 定義為一個酶活力單位。 GAD(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0017)÷4.3244]×(V2÷V3)÷V1÷T×103=481.8×(ΔA+0.0017) V---提取液體積，1mL； V1---加入反應體系中樣本體積，0.1mL； V2---反應體系總體積，0.5mL； V3---第②步顯色階段上清液量，0.08mL； T---反應時間，30min； W---樣本質量，g； 標準品 GABA 分子量---103.12； 500---細胞數量，萬； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 標準品母液（1mg/mL）：向 EP 管中加入 2mL 蒸餾水；把母液稀釋成以下濃度梯度：0, 0.06, 0.12, 0.18, 0.24, 0.3 mg/mL。也可根據實際樣本來調整標準品濃度。 2 按照顯色反應階段的測定管加樣體系操作，根據結果即可制作標準曲線。