GABA轉氨酶(GABA-T)試劑盒

GABA轉氨酶(GABA-T)試劑盒

GABA轉氨酶(GABA-T)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 γ-氨基丁酸轉氨酶（GABA-T）測定試劑盒說明書 （貨號：WS3011F 分光法 24 樣） 一、產品簡介： γ-氨基丁酸轉氨酶(GABA-T，EC 2.6.1.96)是 GABA 支路中的關鍵酶之一，催化 GABA 的降解和轉化。 本試劑盒利用γ-氨基丁酸轉氨酶（GABA-T）催化丙酮酸和 GABA 反應生成生成琥 珀酸半醛和丙an酸，通過檢測 GABA 的減少量進而得出 GABA-T 酶活力大小。 反應方程式：4-aminobutanoate + pyruvate = succinate semialdehyde + L-alanine 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部， 再加 3mL 試劑三溶解備用。 試劑二 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部， 再加 5mL 試劑三溶解備用。 試劑三 液體 8mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 11mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 10mL×1 支 4℃保存 試劑六 A：液體 13mL×2 瓶 B：液體 2mL×1 瓶 4℃保存 臨用前取 0.9mL 的 B 液進一瓶 A 液中，混勻后作為試劑六使用。 混勻后的試劑六半個月內用完。 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋、離心機、可調式移液器、 研缽、冰和蒸餾水。 四、γ-氨基丁酸轉氨酶（GABA-T）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣本情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、 樣本制備： 取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清液待用。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 2、 上機檢測： 1 可見分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 645nm，蒸餾水調零。 ② 所有試劑解凍至室溫，在 EP 管依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 80 80 試劑一 80 蒸餾水 80 試劑二 80 80 混勻，于 30℃孵育 30min 試劑四 160 160 立即混勻，室溫 12000rpm，離心 5min，上清液待測本試劑盒僅供科研使用 2 ③ 顯色反應：于 EP 管依次加入： 上清液 100 100 試劑四 60 60 試劑五 200 200 試劑六 400 400 混勻，沸水?。?/span>95-100℃）10min，冰浴至室溫，呈現藍綠色顏 色，全部液體轉移至 1mL 玻璃比色皿中，于 645nm 處讀取各管 的 A 值，△A=A 對照-A 測定(每個樣本需做一個自身對照)。 【注】若ΔA 值在零附近，可增加樣本質量 W（如增至 0.2g），或延長 30℃孵育時間 T（如增 至 1h 或更長），或加大樣本量 V1（如增至 1500μL，則試劑四相應減少），則改變后的 W 和 T 和 V1 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線：y = 0.8609x - 0.0032，x 為標準品濃度(mg/mL)，y 為吸光值ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白每小時消耗 1mg 的 GABA 定義為一個酶活力單位。 GABA-T 活力(mg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0032)÷0.8609]×V2÷(V1×Cpr)÷T =11.62×(ΔA+0.0032)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織每小時消耗 1mg 的 GABA 定義為一個酶活力單位。 GABA-T 活力(mg/h/g 鮮重)=[(ΔA+0.0032 ÷0.8609]×V2÷(W×V1÷V)÷T =11.62×(ΔA+0.0032)÷W 4、按細菌/細胞數量計算： 單位定義：每 104個細胞每小時消耗 1mg 的 GABA 定義為一個酶活單位。 GABA-T 活力(mg/h/104 cell)=[(ΔA+0.0032)÷0.8609]×V2÷(500×V1÷V)÷T =0.03×(ΔA+0.0032) 5、按照液體體積計算： 單位定義：每毫升液體每小時消耗 1mg 的 GABA 定義為一個酶活力單位。 GABA-T 活力(mg/h/mL)=[(ΔA+0.0032)÷0.8609]×V2÷V1÷T=11.62×(ΔA+0.0032) V---提取液體積，1mL； V1---加入反應體系中樣本體積，0.08mL； V2---反應體系總體積：0.4mL； T---反應時間，30min=0.5h； W---樣本質量，g； Cpr----樣本蛋白質濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 標準品母液（2mg/ml）：標準品臨用前加 1mL 蒸餾水溶解。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標準品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2 mg/ml。也可根據實 際樣本來調整標準品濃度。 3 按照顯色反應階段的測定管加樣體系操作，根據結果即可制作標準曲線。