GABA轉氨酶(GABA-T)試劑盒,微板法

GABA轉氨酶(GABA-T)試劑盒,微板法

GABA轉氨酶(GABA-T)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 γ-氨基丁酸轉氨酶（GABA-T）測定試劑盒說明書 （貨號：WS3011W 微板法 48 樣） 一、產品簡介： γ-氨基丁酸轉氨酶(GABA-T，EC 2.6.1.96)是 GABA 支路中的關鍵酶之一，催化 GABA 的降解和轉化。 本試劑盒利用γ-氨基丁酸轉氨酶（GABA-T）催化丙酮酸和 GABA 反應生成生成琥 珀酸半醛和丙*酸，通過檢測 GABA 的減少量進而得出 GABA-T 酶活力大小。 反應方程式：4-aminobutanoate + pyruvate = succinate semialdehyde + L-alanine 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部， 再加 3mL 試劑三溶解備用。 試劑二 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部， 再加 4.5mL 試劑三溶解備用。 試劑三 液體 8mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 11mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 試劑六 A：液體 8mL×3 瓶 B：液體 2mL×1 支 4℃保存 臨用前取0.55mL的B液進一瓶A 液中，混勻后作為試劑六使用。 混勻后的試劑六半個月內用完。 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、水浴鍋、離心機、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、γ-氨基丁酸轉氨酶（GABA-T）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣本情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、 樣本制備： 取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清液待用。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 2、 上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 645nm。 ② 所有試劑解凍至室溫，在 EP 管依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 40 40 試劑一 40 蒸餾水 40 試劑二 40 40 混勻，于 30℃孵育 30min 試劑四 80 80 立即混勻，室溫 12000rpm，離心 5min，上清液待測本試劑盒僅供科研使用 2 ③ 顯色反應：于 EP 管中依次加入： 上清液 50 50 試劑四 30 30 試劑五 100 100 試劑六 200 200 混勻，沸水浴（95-100℃）10min，冰浴至室溫，呈現藍綠色顏 色，若渾濁需 12000rpm 離心 5min，取澄清的 200μL 至 96 孔板 中，于 645nm 處讀取各管的 A 值，△A=A 對照-A 測定(每個樣本 需做一個自身對照)。 【注】若ΔA 值在零附近，可增加樣本質量 W（如增至 0.2g），或延長 30℃孵育時間 T（如增至 1h 或更長），或加大樣本量 V1（如增至 80μL，則試劑四相應減少），則改變后的 W 和 T 和 V1 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線：y = 0.508x - 0.0003，x 為標準品質量(mg/mL)，y 為吸光值ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白每小時消耗 1mg 的 GABA 定義為一個酶活力單位。 GABA-T (mg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0003)÷0.508]×V2÷(V1×Cpr)÷T=19.7×(ΔA+0.0003)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織每小時消耗 1mg 的 GABA 定義為一個酶活力單位。 GABA-T (mg/h/g 鮮重)=[(ΔA+0.0003)÷0.508]×V2÷(W×V1÷V)÷T =19.7×(ΔA+0.0003)÷W 4、按細菌/細胞數量計算： 單位定義：每 104個細胞每小時消耗 1mg 的 GABA 定義為一個酶活單位。 GABA-T (mg/h/104 cell)=[(ΔA+0.0003)÷0.508]×V2÷(500×V1÷V)÷T =0.04×(ΔA+0.0003) 5、按照液體體積計算: 單位定義：每毫升液體每小時消耗 1mg 的 GABA 定義為一個酶活力單位。 GABA-T(mg/h/mL)=[(ΔA+0.0003)÷0.508]×V2÷V1÷T=19.7×(ΔA+0.0003) V---提取液體積，1mL； V1---加入反應體系中樣本體積，0.04mL； V2---反應體系總體積：0.2mL； T---反應時間，30min=0.5h； W---樣本質量，g； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 標準品母液（2mg/ml）：標準品臨用前加 1mL 蒸餾水溶解。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標準品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2 mg/ml。也可根據實 際樣本來調整標準品濃度。 3 按照顯色反應階段的測定管加樣體系操作，根據結果即可制作標準曲線。