尿素(Urea)/尿素氮含量(脲酶法),微板法

尿素(Urea)/尿素氮含量(脲酶法),微板法

尿素(Urea)/尿素氮含量(脲酶法),微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 尿素（Urea）含量（酶法）檢測試劑盒說明書 （貨號：WS1021W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 尿素（Urea）又稱碳酰胺，舊稱尿素氮（BUN），是哺乳動物和某些魚類體內蛋白質 代謝分解的主要含氮產物，也是目前含氮量的氮肥。 該試劑盒利用尿素在脲酶的作用下水解產生氨離子和二氧化碳，氨離子在堿性介質中 與酚顯色劑生成藍色物質，該物質的生成量與尿素含量成正比。通過于625nm處檢測該 有色物質含量進而得出尿素氮含量。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 試劑一 粉體 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，再加 1.1mL 的蒸餾水溶解備用。 試劑二 液體 3mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 試劑三 A×2 支 試劑三 B×1 支 4℃保存 臨用前向一支試劑三 A 中加入 46μL 的試劑三 B，混勻備用。 標準管 粉體 mg×2 支 4℃保存 每支臨用前加1mL蒸餾水溶解，即濃 度為6mg/mL的尿素，檢測前再用蒸餾 水稀釋200倍（5:995）即成0.03mg/mL （0.5mmol/L）的尿素。 三、所需儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、天平、移液器、離心機、蒸餾水。 四、尿素（Urea）含量檢測： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實 驗樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 液體樣品：液體樣品：澄清的液體可直接檢測；若渾濁則離心后取上清液檢測。 ② 細菌/細胞樣本： 先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細胞加入 1mL 生 理鹽水，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；12000rpm 室溫離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min，設置溫度在 37℃，設定波長到 625nm。 ② 做實驗前選取 2 個樣本，找出適合本次檢測樣本的稀釋倍數 D（如：尿液樣本可用 蒸餾水稀釋 100 倍）。 ③ 所有試劑解凍至室溫，在 96 孔板中依次加入：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱 （μL） 測定管 空白管 （僅做一次） 標準管 （僅做一次） 樣本 20 蒸餾水 20 標準品 20 試劑一 10 10 10 蒸餾水 130 130 130 混勻，37℃避光反應 15min 試劑二 20 20 20 試劑三 20 20 20 混勻，37℃避光反應 20min，于 625nm 處讀取吸光值 A， △A=A 測定-A 空白。 【注】：1.測定管的 A 值若超過 1.5，可把樣本用生理鹽水或蒸餾水進行稀釋，稀釋倍數 D 代入計 算公式。 2.若△A 的差值在零附近徘徊，可增加樣本加樣量 V1（如增至 50μL，則蒸餾水相應減少， 保持總體積不變；空白管和標準管維持不變），則改變后的 V1 需代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、按液體體積計算： 尿素含量(mg/L)=(C 標準×V 標)×103×△A÷(A 標準-A 空白)÷V1×D =30×△A÷(A 標準-A 空白)×D 尿素含量(mmol/L)=(C 標準×V 標)÷60.04×103×△A÷(A 標準-A 空白)÷V1×D =0.5×△A÷(A 標準-A 空白)×D 2、按細胞數量計算： 尿素含量(ng/104 cell)=(C 標準×V 標)×106×△A÷(A 標準-A 空白)÷(500×V1÷V)×D =60×△A÷(A 標準-A 空白)×D 尿素含量(nmol/104 cell)=(C 標準×V 標)÷60.04×106×△A÷(A 標準-A 空白)÷(500×V1÷V)×D =△A÷(A 標準-A 空白)×D C 標準---尿素標品濃度，0.03mg/mL； D---稀釋倍數，未稀釋即為 1； V1---加入樣本體積，0.02mL； V 標---加入標準品體積，0.02mL； V---提取液體積，1mL； 60.04---尿素分子量； 500---細胞數量，萬。