土壤羥胺還原酶(HR)試劑盒,微板法

土壤羥胺還原酶(HR)試劑盒,微板法

土壤羥胺還原酶(HR)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 土壤羥胺還原酶（hydroxylamine reductase,HR）試劑盒說明書 （貨號：WS4330W 微板法 48 樣） 一、產品簡介： 土壤羥胺還原酶能將土壤中氮代謝過程中形成的中間產物羥胺還原為氨，土壤中的還原 態化合物可作為氫的供體，其強弱影響到土壤氮代謝過程中氮素的氨揮發損失，間接影響 氮肥的利用效率。 硫酸鐵銨中的 Fe3+可將羥胺氧化為氮氣，自身被還原為 Fe2+，Fe2+在弱酸條件下與鄰 菲羅琳形成橙紅色配合物，在 510nm 處有吸收峰，羥胺還原酶作用于羥胺，使配合物形 成量減少，510nm 處吸光值的減少可反映羥胺還原酶的活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 試劑一 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部， 再加 3mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部， 再加 5mL 蒸餾水溶解備用。 試劑三 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 8mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 4mL×1 瓶 4℃保存 試劑六 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部， 再加 3mL 蒸餾水溶解備用。 試劑七 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部， 再加 3mL 無水乙醇溶解備用。 標準品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、可調式移液器、天平、常溫離心機、震蕩儀、氮吹儀。 四、土壤羥胺還原酶（HR）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： 土取新鮮土樣風干或者 37 度烘箱風干，先粗研磨，過 40 目篩網備用。 【注】：1.壤表層溶解氧濃度較大，取樣應取表層 5cm 以下的土壤，否則酶活性較低或者測定不到。 2.土壤風干，減少土壤中水分對于實驗的干擾；土壤過篩，保證取樣的均勻細膩； 2、上機檢測： 1 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 510nm。 2 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 3 試劑三盡量不要敞口放置，取完立即加蓋擰緊。 4 反應體系能用氮吹儀排除溶解氧，若無此裝置，則加入試劑三后立即密封。 5 在 1mLEP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 空白管 測定管 對照管 風干土樣（g） 0.02 0.02 試劑一 40 40 蒸餾水 40本試劑盒僅供科研使用 2 試劑二 40 40 40 試劑三 120 120 120 混勻后，用 N2氣流排除管中空氣，立即密封，于 30℃反應 1h 試劑四 80 80 80 充分震蕩 10min，8000rpm，室溫（25℃）離心 10min，取上清液待測。 6 顯色反應，在 96 孔板中依次加入： 上清液 20 20 20 試劑五 40 40 40 試劑六 20 20 20 試劑七 20 20 20 蒸餾水 100 100 100 充分混勻，25℃靜置顯色 10min，于 510nm 處讀取各管吸光值 A， △A＝A 空白－（A 測定－A 對照）。 【注】若△A 在零附近徘徊，可加大土壤取樣量（如增至 0.05g），或延長 30℃的反應時間至 4h 或更 長，或在顯色反應階段加大上清液的量（如增加至 50μL，則蒸餾水相應減少）。則改變后的 樣本質量 W 或反應時間 T 或上清液體積 V2 需代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y = 1.1234x - 0.0029，x 是標準品羥胺質量（μg），y 是△A。 2、酶活定義：每克土壤每小時轉化 1μg 羥胺為一個酶活力單位。 HR 活性(μg/d /g 土樣)=(△A+0.0029)÷1.1234×(V1÷V2)÷W÷T =12.5×(△A+ 0.0029)÷W V1---加入提取液體積，0.28mL； V2---顯色反應階段上清液體積，0.02mL W---樣本質量，g； T---1h。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（1mg/mL）：向標準品 EP 管里面加入 2ml 蒸餾水（母液需在兩天 內用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 mg/mL。也可根 據實際樣本來調整標準品濃度。 3 依據顯色反應階段加樣體系操作，20μL 上清液換成標準品，以標準品的質量為橫坐 標，吸光值為縱坐標，即可制作標準曲線。