土壤芳基酰胺酶活性測定試劑盒

土壤芳基酰胺酶活性測定試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 土壤芳基酰胺酶活性測定試劑盒說明書 （貨號：WS4430F 分光法 24 樣） 一、產品簡介： 土壤芳基酰胺酶（Aryl-acylamidase，EC 3.5.1.13）可水解帶有酰胺基團的化合物；本 試劑盒利用土壤芳基酰胺酶水解底物 L-亮*酸β-萘胺生成β-萘胺，β-萘胺接著與對二甲 氨基肉桂醛生成紅色偶氮化合物，該化合物于 540nm 處有特征吸收峰，通過檢測該紅色 物質的增加速率，即可計算土壤芳基酰胺酶活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 試劑一 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部，再 加入 6mL 蒸餾水，充分溶解備用， 試劑三 液體 14mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉劑 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部，再 加入 15mL 乙醇，充分溶解備用。 標準品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、天平、離心機、恒溫水浴鍋、乙醇、 可調式移液器。 四、土壤芳基酰胺酶活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣本情況，熟悉實驗流程，避免實 驗樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： 取新鮮土樣風干或者 30℃烘箱風干，先粗研磨，過 40 目篩，備用。 【注】：土壤風干，減少土壤中水分對于實驗的干擾；土壤過篩，保證取樣的均勻細膩； 2、上機檢測： ① 可見分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 540nm，蒸餾水調零。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 0.1g 土壤 0.1g 土壤 試劑一 300 300 試劑二 100 混勻，于 37℃孵育 2h（間隔 30min 振蕩混勻一次） 95%乙醇 600 600 試劑二 100 立即混勻，于 12000rpm，室溫或 4℃離心 10min，離心 10min， 上清液待測。本試劑盒僅供科研使用 2 ③ 顯色反應，在 EP 管中依次加入： 上清液 280 280 試劑三 280 280 試劑四 280 280 混勻，10min 后，全部液體轉移至 1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）中，于 540nm 處測定吸光值 A， △A=A 測定-A 對照（每個樣本做一個自身對照）。 【注】：1.若△A 值在零附近徘徊，可在 37℃孵育階段延長反應時間 T(如增至 3h 或更長)，或增 加土壤樣本量 W（如增至 0.2g），則改變后的反應時間 T 和 W 需代入公式重新計算。 2. 若 A 測定的值大于 1.8，可用乙醇對整個紅色顯色反應液進行稀釋，則稀釋倍數 D 需代入公式參與計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y = 0.0546x - 0.016，x 是標準品濃度（μg/mL）, y 是△A。 2、酶活定義：37℃條件下，每克土樣每小時釋放出 1μg 的β-萘胺為一個酶活力單位。 土壤芳基酰胺酶活性(μg/h/g 土樣)=(△A+0.016)÷0.0546×V1÷W÷T =9.2×(△A+0.016)÷W V1---孵育階段的反應總體積，1mL； T---反應時間，2h； W---樣本質量，g； 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（2.5mg/mL）：標準品用 1mL 乙醇溶解。（母液需在兩天內用）。 2 把母液用蒸餾水稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 5, 10, 15, 20, 25. μg/mL。也可根 據實際樣本來調整標準品濃度。 3 依據顯色反應階段測定管的加樣體系操作，根據結果即可制作標準曲線。