NADH-谷an酸合成酶(NADH-GOGAT)試劑盒

NADH-谷an酸合成酶(NADH-GOGAT)試劑盒

NADH-谷an酸合成酶(NADH-GOGAT)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 NADH-谷*酸合成酶（Glutamate synthase, NADH-GOGAT）試劑盒說明書 （貨號：WS3040F 紫外分光法 48 樣） 一、產品簡介： 谷*酸合成酶（GOGAT)廣泛分布于植物中，植物吸收的無機氮經硝酸還原糖（NR）和亞硝酸還原酶 （NIR）還原成 NH4+后，通過谷氨*胺合成酶（GOGAT）參與的 GS/GOGAT 途徑才能進行氮素的同化和 利用。GOGAT 一般包含兩類：一類是多存在于葉綠體（葉片）中的 Fd-GOGAT，另一類是多存在于非綠 色組織（根）前質體中的 NADH-GOGAT。 NADH-谷*酸合成酶（NADH-GOGAT，EC 1.4.1.14) 催化谷*酰胺的氨基轉移到α-酮戊二酸，形成兩 分子的谷*酸；同時 NADH 氧化生成 NAD+，可以通過檢測 340nm 吸光度的下降速率得出 NADH-GOGAT 的酶活性大小。 該酶催化的反應：L-glutamine + 2-oxoglutarate + NADH + H+=2 L-glutamate + NAD+ 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×2 支 4℃保存 用前甩幾下或 4℃離心使試劑落入試 管底部，每瓶加入 4.2mL 的提取液充 分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保 存，禁止反復凍融，三天內用完。 試劑二 粉劑 mg×2 瓶 4℃保存 用前甩幾下或 4℃離心使試劑落入試 管底部，每瓶加入 14mL 的提取液充分 溶解，仍 4℃保存。 三、所需的儀器和用品： 紫外分光光度計、1mL 石英比色皿（光徑 1cm）、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液 器、研缽、冰和蒸餾水。 四、NADH-GOGAT 酶活性檢測： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、粗酶液提取： 稱取約 0.1g 組織（水分多的樣本取 0.5g），加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。12000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取。若樣本 顏色較深（如植物葉片），可引起起始值 A1 值較大如超過 1.5，可在樣本制備過程中增加除色素步 驟：取約 0.2g 組織（水分充足的樣本可取 1g），加入 80%乙醇冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min， 棄掉色素較深的上清液；以上除色素步驟重復 2 次。最后向離心得到的沉淀中加入 1mL 提取液， 混勻或再次冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。 2、測定步驟： ① 紫外分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。 ② 在 1mL 石英比色皿（光徑 1cm）中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 80 試劑一 160 試劑二 560本試劑盒僅供科研使用 2 混勻，于 340nm 下檢測，1min 時讀取 A1，10min 后讀取 A2 值， ΔA=A1-A2。 【注】1.若 A1 太大如超過 2（如顏色較深的植物葉片，一般色素較高，則起始值相對會偏高），可以 適當減少樣本加樣量 V1（如減至 40μL，另外 40μL 用提取液補齊），則改變后的 V1 需代入計 算公式重新計算?；蛘邷p少試劑一的加樣量（如減至 80μL，另外 80μL 用蒸餾水補齊） 或向待測樣本中加少許活性炭混勻靜置 5min 后 12000rpm, 4℃離心 10min，上清液用于檢測； 2. 若ΔA 的值大于 0.4，則需減少反應時間（如減少至 5min），則改變后的反應時間 T 需代入計 算公式重新計算。 3. 若下降趨勢不穩定，可以每隔 20S 讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時間段來參與計算， 相對應的 A 值也代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。 NADH-GOGAT(nmol Glu/min/mg prot）=2×[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr) ÷T =3215.4 ×ΔA÷Cpr ÷T 2、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。 NADH-GOGAT（nmol Glu/min/g 鮮重）=2×[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V) ÷T =3215.4×ΔA÷W÷T V--提取液體積，1 mL； V1--加入樣本體積，0.08mL； V2--反應總體積，8×10-4 L； ε--NADH 摩爾消光系數，6.22×103 L/mol/cm； d--1mL 石英比色皿光徑，1cm； W--樣本質量，g； T--反應時間，本實驗中是 10min，若線性區間的時間改變則以實際檢測時間代入公式計算； 2--每合成 2nmol 的 Glu 有 1nmol 的 NADH 被氧化； Cpr--樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司 BCA 蛋白含量測定試劑盒。