外切葡聚糖酶纖維二糖水解酶(CBH)微板法

外切葡聚糖酶纖維二糖水解酶(CBH)微板法

外切葡聚糖酶纖維二糖水解酶(CBH)微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 土壤外切-β-1,4-葡聚糖酶（S-CBH）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書 (貨號(hào)：WS3230W 微板法 96 樣) 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 土壤外切-β-1,4-葡聚糖酶又稱土壤纖維二糖水解酶（CBH，EC 3.2.1.91）是土壤纖維素 酶系的組份之一，該酶作用于β-1,4-糖苷鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖（還原糖）分子，本 試劑盒采用該酶催化對(duì)硝基苯基-β-D-纖維二糖苷生成黃色物質(zhì)對(duì)-硝基*酚（PNP），該物 質(zhì)在 405nm 有特征光吸收，進(jìn)而得到土壤外切-β-1,4-葡聚糖酶（S-CBH）活性大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 試劑一 液體 120mL×1 瓶 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉體 mg×4 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部， 每支再加入 1.4mL 蒸餾水溶解， 4 度保存。 試劑三 液體 40mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋或恒溫振蕩培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、蒸餾水。 四、土壤外切-β-1,4-葡聚糖酶活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： 取新鮮土樣或干土（風(fēng)干或者 37 度烘箱風(fēng)干），先粗研磨，過(guò) 40 目篩網(wǎng)備用。 【注】：土壤風(fēng)干，減少土壤中水分對(duì)于實(shí)驗(yàn)的干擾；土壤過(guò)篩，保證取樣的均勻細(xì)膩； 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 405nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 空白管（僅做一次） 土樣（g） 0.1 0.1 試劑一 750 800 750 試劑二 50 50 充分混勻，37℃培養(yǎng) 2 小時(shí)（振蕩培養(yǎng)或間隔 20min 手動(dòng)振蕩 混勻幾下） 試劑三 200 200 200 混勻，8000rpm 離心 5min（若上清液不澄清可加大離心力），取 200μL 上清液至 96 孔板中，405nm 下讀取吸光值 A，△A=A 測(cè) 定- A 對(duì)照-A 空白（每個(gè)樣本做一個(gè)自身對(duì)照）。 【注】：1.若ΔA 較小，可延長(zhǎng) 37℃的孵育時(shí)間 T（如增至 4 小時(shí)或更長(zhǎng)），或增加土樣質(zhì) 量 W（如增至 0.3g）。則改變后的 T 和 W 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2.若測(cè)定管 A 值大于 1.5 或△A 大于 1.5，可縮短 37℃的孵育時(shí)間 T（如減至 0.5 小時(shí)或更短）， 或減少土樣質(zhì)量 W（如減至 0.05g）。則改變后 T 和 W 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。或?qū)ψ?/span>本試劑盒僅供科研使用 2 后一步的待檢測(cè)上清液（包括測(cè)定管、對(duì)照管和空白管）同時(shí)用蒸餾水進(jìn)行稀釋，稀釋倍 數(shù) D 代入計(jì)算公式。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.0108x + 0.0053；x 為標(biāo)準(zhǔn)品摩爾質(zhì)量（nmol），y 為△A。 2、單位定義：每小時(shí)每克土樣中產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基*酚（PNP）定義為一個(gè)酶活單位。 S-CBH 活力(nmol/h/g 土樣)=(ΔA-0.0053) ÷0.0108÷W÷T×D =46.3×(ΔA-0.0053)÷W×D T---反應(yīng)時(shí)間，2h； W---土壤樣本實(shí)際取樣量，g； PNP 相對(duì)分子質(zhì)量---139.11。 D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（10μmol/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1.4mL 蒸餾水超聲溶解。 2 把母液用蒸餾水稀釋成以下濃度：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本 來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 在 EP 管加入：50μL 標(biāo)準(zhǔn)品+750μL 試劑一+200μL 試劑三，混勻，取 200μL 至 96 孔板中，于 405nm 下讀取吸光值，根據(jù)結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。