土壤亞硝酸還原酶(S-NiR)試劑盒,微板法

土壤亞硝酸還原酶(S-NiR)試劑盒,微板法

土壤亞硝酸還原酶(S-NiR)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 土壤亞硝酸還原酶（Solid-Nitrite reductase，S-NiR）試劑盒說(shuō)明書(shū) (貨號(hào)：WS0130W 微板法 48 樣) 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 土壤亞硝酸還原酶是反硝化作用的關(guān)鍵酶，它是由土壤反硝化細(xì)菌產(chǎn)生的一種還原類(lèi) 酶，參與亞硝酸鹽至 NO 的還原反應(yīng)，它的活性反映了生物降解過(guò)程中氮素的轉(zhuǎn)化效率， 為氮素轉(zhuǎn)化規(guī)律的研究提供一定的依據(jù)。 土壤亞硝酸還原酶可將 NO2-還原為 NO，使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成（粉）紅色化 合物的 NO2-減少，該（粉）紅色物質(zhì)在 540nm 有吸收峰，通過(guò)檢測(cè) 540nm 處吸光 值的變化來(lái)反應(yīng)土壤亞硝酸還原酶的活性。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱(chēng) 規(guī)格試劑名稱(chēng) 保存要求 備注 試劑一 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體 55mL×1 瓶 4℃保存 有沉淀，臨用前混勻即可 試劑三 液體 22mL×1 瓶 4℃保存 試劑會(huì)出現(xiàn)過(guò)飽和，臨用前 25℃水浴， 5min 即可使用 試劑四 A 液 12mL×1 瓶 4℃保存 臨用前，可依據(jù)待檢測(cè)樣本數(shù)量，把 A 液和 B 液等比例混合成無(wú)色的反應(yīng) mix （注意觀(guān)察，若變粉色，則不能使用）。 兩天之內(nèi)用完。 B 液 12mL×1 瓶 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、天平、水浴鍋、低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液器。 四、土壤亞硝酸還原酶（S-NiR）的測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備 取新鮮土樣風(fēng)干或者 37 度烘箱風(fēng)干，先粗研磨，過(guò) 40 目篩網(wǎng)，備用。 【注】：土壤風(fēng)干，減少土壤中水分對(duì)于實(shí)驗(yàn)的干擾；土壤過(guò)篩，保證取樣的均勻細(xì)膩； 2、測(cè)定步驟 ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱(chēng)（μL） 測(cè)定管 無(wú)基質(zhì)對(duì)照管 無(wú)土對(duì)照管 （僅做一次） 土樣（g） 0.1 0.1 試劑一 400 400 蒸餾水 800 1200 800 試劑二 500 500 500 混勻，且務(wù)*用封口膜封口，25℃，培養(yǎng) 24h 試劑三 200 200 200本試劑盒僅供科研使用 2 混勻，12000rpm，4℃離心 10min，上清液待用。 ③ 顯色反應(yīng)，②步得到的上清液用蒸餾水稀釋 50 倍后，在 96 孔板中依次加： 上清液 20 20 20 反應(yīng) mix 200 200 200 混勻，25℃反應(yīng) 5min（準(zhǔn)確時(shí)間），立即于 540nm 處讀取 A 值，△A=A 無(wú)土對(duì)照管-（A 測(cè)定管-A 無(wú)基質(zhì)對(duì)照管），（每個(gè)樣本需做一個(gè)自身 對(duì)照）。 【注】：若△A 值低于 0.01，可增加土壤樣本取樣質(zhì)量 W（如由 0.1g 增至 0.25g），則改變 后的 W 需帶入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程：y = 2.2688x - 0.0011；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmoL/mL），y 為吸光值△A。 2、單位定義：每克土壤每天還原 1μmoL 的 NO2 ˉ量為一個(gè)酶活力單位。 S-NiR(μmoL/d/g 土壤)=[(△A+0.0011)÷2.2688×V1]÷W÷T×D =0.84×(△A+0.0011)÷W×50 3、單位定義：每克土壤每天還原 1μg 的 NO2 ˉ量為一個(gè)酶活力單位。 S- NiR(μg/d/g 土壤)=[(△A+0.0011)÷2.2688×V1]÷W÷T×46×D =38.64×(△A+0.0011)÷W×50 V1---反應(yīng)體系總體積，1900μL=1.9mL； T---反應(yīng)時(shí)間，24h=1d； W---土樣實(shí)際質(zhì)量，g； D---稀釋倍數(shù)，50 倍； 標(biāo)準(zhǔn)品的分子量---69； NO2 -的分子量---46。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（100μmol/mL）：把標(biāo)準(zhǔn)品*全溶解于 1mL 蒸餾水中（母液需在兩 天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸餾水稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5. μmol/mL。也 可根據(jù)實(shí)際樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)顯色反應(yīng)階段的測(cè)定管的加樣順序操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。